An unnatural base pair system for efficient PCR amplification and functionalization of DNA molecules.
An unnatural base pair system for efficient PCR amplification and functionalization of DNA molecules.
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DOI：
10.1093/nar/gkn956
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发表时间：
2009-02
影响因子：
14.9
通讯作者：
Hirao I
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kimoto M;Kawai R;Mitsui T;Yokoyama S;Hirao I
为了扩大遗传字母表，我们提出了一种非天然的碱基对系统，用于高效的PCR扩增，使额外的功能成分位点特异性地掺入DNA中。该系统可应用于采用含有非天然碱基、天然和非天然碱基三磷酸和精通3′→5′核酸外切酶的DNA聚合酶的DNA模板的常规PCR方案。对于涉及非天然碱基配对的高度忠实和有效的PCR扩增，我们通过体外选择技术，使用含有非天然碱基的DNA文库，鉴定了DNA模板中非天然碱基周围的天然碱基序列。该系统有助于将与感兴趣的官能团连接的各种修饰的非天然碱基位点特异性掺入扩增的DNA中。含有非天然碱基对的DNA片段（阿莫尔）可以通过30个PCR循环扩增107倍，非天然碱基对位点的总突变率<1%。使用该系统，我们证明了高效的PCR扩增和DNA片段的功能化，用于从含有过量（pmol规模）外源DNA物质的混合物中极其灵敏地检测zeptomol规模的靶DNA分子。这种非天然碱基对系统将适用于广泛的基于DNA/RNA的技术。
Toward the expansion of the genetic alphabet, we present an unnatural base pair system for efficient PCR amplification, enabling the site-specific incorporation of extra functional components into DNA. This system can be applied to conventional PCR protocols employing DNA templates containing unnatural bases, natural and unnatural base triphosphates, and a 3′→5′ exonuclease-proficient DNA polymerase. For highly faithful and efficient PCR amplification involving the unnatural base pairing, we identified the natural-base sequences surrounding the unnatural bases in DNA templates by an in vitro selection technique, using a DNA library containing the unnatural base. The system facilitates the site-specific incorporation of a variety of modified unnatural bases, linked with functional groups of interest, into amplified DNA. DNA fragments (0.15 amol) containing the unnatural base pair can be amplified 107-fold by 30 cycles of PCR, with <1% total mutation rate of the unnatural base pair site. Using the system, we demonstrated efficient PCR amplification and functionalization of DNA fragments for the extremely sensitive detection of zeptomol-scale target DNA molecules from mixtures with excess amounts (pmol scale) of foreign DNA species. This unnatural base pair system will be applicable to a wide range of DNA/RNA-based technologies.
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