HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定
HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定
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DOI：
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发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
李锦源
中科院分区：
文献类型：
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作者：
邱华;林栋毅;李锦源
目的：采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型, 筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株；方法：构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒; 以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2, 以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin, BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1.3-fold HBV-HepG2), 继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列. 将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆, 通过测序各单克隆细胞的侧翼序列, 以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置, 再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平, 筛选出最优势单克隆株. 将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代, 比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性；(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI = 30的参数侵染HepG2细胞, 72 h后加入BSD抗生素(终浓度1 μg/mL)进行筛选, 连续培养15-20 d后, 获得1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞系, PCR鉴定出HBV DNA序列; (2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中, 编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、HBeAg表达水平最高, 分别为24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL, 其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715, 确定为优势单克隆株; (3)与HepG2.2.15细胞株比较, HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBsAg、HBeAg、HBx、HBV DNA、cccDNA, 差异均具有统计学意义(P<0.05)；结论：成功构建并筛选出1.3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14, 这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础。