Single 3'-exonuclease-based multifragment DNA assembly method (SENAX).
Single 3'-exonuclease-based multifragment DNA assembly method (SENAX).
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基于单个3'-核酸酶基于多因子DNA组装方法（SENAX）。
DOI：
10.1038/s41598-022-07878-x
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发表时间：
2022-03-07
影响因子：
4.6
通讯作者：
Poh CL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Dao VL;Chan S;Zhang J;Ngo RKJ;Poh CL
DNA组装是生物技术和合成生物学研究中的一个重要过程，在此过程中，使用生物部件设计和构建DNA质粒以工程化微生物用于广泛的应用。在这里，我们提出了一种基于酶促同源性的DNA组装方法，SENAX（Stellar ExoNuclease Assembly miX），该方法可以在30至37 °C的环境温度下有效地组装多个DNA片段，并且需要短至12-18个碱基对的同源性重叠。SENAX仅依赖于3′-5′核酸外切酶XthA（ExoIII），然后进行大肠杆菌转化，从而易于放大和优化。重要的是，SENAX可以有效地将低至70 bp的短片段组装到载体中，克服了现有常用的基于同源性的技术的关键缺点。据我们所知，这在其他地方使用基于同源性的方法还没有报道。这一优势使我们开发了一种框架，使用可重复使用的启动子-RBS短片段以更模块化的方式进行DNA组装，简化了构建过程并降低了DNA合成的成本。这种方法使得通常使用的短生物部件（例如，启动子、RBS、绝缘子、终止子），以通过将这些部分直接组装成中间构建体而重复使用。SENAX代表了一种新的准确，高效，自动化友好的DNA组装方法。
DNA assembly is a vital process in biotechnology and synthetic biology research, during which DNA plasmids are designed and constructed using bioparts to engineer microorganisms for a wide range of applications. Here, we present an enzymatic homology-based DNA assembly method, SENAX (Stellar ExoNuclease Assembly miX), that can efficiently assemble multiple DNA fragments at ambient temperature from 30 to 37 °C and requires homology overlap as short as 12–18 base pairs. SENAX relies only on a 3′–5′ exonuclease, XthA (ExoIII), followed by Escherichia coli transformation, enabling easy scaling up and optimization. Importantly, SENAX can efficiently assemble short fragments down to 70 bp into a vector, overcoming a key shortcoming of existing commonly used homology-based technologies. To the best of our knowledge, this has not been reported elsewhere using homology-based methods. This advantage leads us to develop a framework to perform DNA assembly in a more modular manner using reusable promoter-RBS short fragments, simplifying the construction process and reducing the cost of DNA synthesis. This approach enables commonly used short bioparts (e.g., promoter, RBS, insulator, terminator) to be reused by the direct assembly of these parts into intermediate constructs. SENAX represents a novel accurate, highly efficient, and automation-friendly DNA assembly method.
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