Monitoring protein misfolding by site-specific labeling of proteins in vivo.
Monitoring protein misfolding by site-specific labeling of proteins in vivo.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0099395
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发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Kramer G
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hsieh TY;Nillegoda NB;Tyedmers J;Bukau B;Mogk A;Kramer G
通过抑制标记琥珀密码子来掺入荧光氨基酸是一种有用的工具，可以用来对蛋白质进行定点标记并显示它们在活细胞中的定位。在这里，我们使用编码正交tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶对的质粒，用环境敏感的荧光氨基酸3-(6-乙酰基萘-2-氨基)-2-氨基丙酸(ANAP)定点标记萤火虫荧光素酶，并探索标记的荧光素酶在酵母细胞质中构象变化的可检测性。我们发现ANAP在[PSI+]细胞中的标记效率大大提高，并表明通过共聚焦成像分析ANAP荧光发射可以跟踪荧光素酶在体内的热展开和聚集。此外，我们证明，流式细胞术可以在单细胞水平上定量地研究荧光素酶和伴侣介导的复性的构象变化。这个实验装置首次允许直接分析活细胞中蛋白质的折叠状态，并可能成为研究蛋白质折叠、错误折叠和聚集机制的有价值的新工具。
Incorporating fluorescent amino acids by suppression of the TAG amber codon is a useful tool for site-specific labeling of proteins and visualizing their localization in living cells. Here we use a plasmid encoded orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to site-specifically label firefly luciferase with the environmentally sensitive fluorescent amino acid, 3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2- aminopropanoic acid (ANAP) and explore the detectability of conformational changes in labeled luciferase in the yeast cytoplasm. We find that ANAP labeling efficiency is greatly increased in [PSI +] cells and show that analysis of the ANAP fluorescence emission by confocal imaging allows for tracking the thermal unfolding and aggregation of luciferase in vivo. Furthermore we demonstrate that flow cytometry can be used to study conformational changes in luciferase and chaperone-mediated refolding in quantitative terms and at the level of single cells. This experimental setup for the first time allows for the direct analysis of the folding state of a protein in living cells and may serve as valuable new tool for examining mechanisms of protein folding, misfolding and aggregation.
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影响因子：
11.4
作者：
STANSFIELD, I;JONES, KM;TUITE, MF
通讯作者：
TUITE, MF
影响因子：
13.8
作者：
Dobson, CM
通讯作者：
Dobson, CM
DOI：
10.1083/jcb.201106037
发表时间：
2011-11-14
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Specht S;Miller SB;Mogk A;Bukau B
通讯作者：
Bukau B
影响因子：
3.7
作者：
Sadlish H;Rampelt H;Shorter J;Wegrzyn RD;Andréasson C;Lindquist S;Bukau B
通讯作者：
Bukau B
影响因子：
15
作者：
Chatterjee A;Guo J;Lee HS;Schultz PG
通讯作者：
Schultz PG