建立 BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用
建立 BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用
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DOI：
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发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
宋晓伟
中科院分区：
文献类型：
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作者：
赵峰;唐文栋;吴弘;郭志福;宋晓伟
目的 通过 BioID- 质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统，通过免疫共沉淀 - 蛋白.质印迹法验证 Yes 相关蛋白 1（YAP1）相互作用的蛋白质。方法 构建 YAP1-BirA* 融合表达质粒，将质粒转染进.293T 细胞后，在细胞培养基中加入 50 μmol/L 生物素，继续培养 24 h 后提取细胞总蛋白质。利用 YAP1 特异抗体，通.过蛋白质印迹法检测 YAP1-BirA* 融合蛋白的表达。利用 HRP- 亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平。通过.亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化，通过多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质，对亲.和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解。取 40 μg 总蛋白进行 SDS-PAGE，然后通过蛋白银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行.染色，确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果。通过非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质。针对鉴定得到.的蛋白质，采用蛋白质印迹法对生物素化的 SMAD 家族成员 3（SMAD3）进行验证。通过 YAP1 的免疫共沉淀确定.SMAD3 能否与 YAP1 相互作用。结果 成功构建 YAP1-BirA* 融合表达质粒，该质粒在 293T 细胞中能够高效表达融.合蛋白。在生物素存在的情况下，YAP1-BirA* 融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与 YAP1-BirA* 融合蛋白邻近的.蛋白质。在细胞裂解后，这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化，经过多次洗涤，能够富.集生物素标记的蛋白质。质谱鉴定显示，能够获得在细胞内与 YAP1 在空间上相互靠近的蛋白质。免疫共沉淀 - 蛋白.质印迹法结果证明 SMAD3 蛋白能与 YAP1 相互作用。结论 Bio-ID- 质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛.选的简单、高效技术，与免疫共沉淀 - 蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系。