Nature of the reaction intermediates in the flavin adenine dinucleotide-dependent epoxidation mechanism of styrene monooxygenase.
Nature of the reaction intermediates in the flavin adenine dinucleotide-dependent epoxidation mechanism of styrene monooxygenase.
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DOI：
10.1021/bi101328r
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发表时间：
2011-02-01
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Gassner, George T.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kantz, Auric;Gassner, George T.
苯乙烯单加氧酶（SMO）是一种双组分黄素酶，由一种NADH特异性黄素还原酶（SMOB）和FAD特异性苯乙烯环氧化酶（NSMOA）组成。NSMOA与还原态的FAD紧密结合，并在S - 环氧苯乙烷的对映选择性合成中催化分子氧的一个原子立体特异性地加成到苯乙烯的乙烯基侧链上。在这个机制中，分子氧首先与NSMOA（FAD还原态）反应生成一个FAD C(4a) - 过氧化物中间体。这种物质无荧光，在382 nm处有最大吸收峰。然后苯乙烯与过氧化物中间体以2.6×10⁶ ± 0.1×10⁶ M⁻¹ s⁻¹的二级速率常数反应，生成在368 nm处有最大吸收峰的荧光中间体。我们计算出氧合步骤的活化自由能为8.7 kcal·mol⁻¹，与过氧化物催化的环氧化所预期的值非常吻合，并且在单周转反应中特定时间点回收的酸淬灭样品表明环氧苯乙烷的合成与荧光中间体的形成阶段是一致的。这些发现支持FAD C(4a) - 过氧化物作为氧原子供体，以及荧光中间体是苯乙烯环氧化的FAD C(4a) - 氢氧化物产物的这一结论。总体而言，需要四个与pH相关的速率常数来拟合单周转动力学，它们分别对应于过氧黄素的形成（pKa = 7.2）、苯乙烯环氧化（pKa = 7.7）、环氧苯乙烷的解离（pKa = 8.3）和羟基黄素的脱水（pKa = 7.6）。
Styrene monooxygenase (SMO) is a two-component flavoenzyme composed of an NADH-specific flavin reductase (SMOB) and FAD-specific styrene epoxidase (NSMOA). NSMOA binds tightly to reduced FAD and catalyzes the stereospecific addition of one atom of molecular oxygen to the vinyl side chain of styrene in the enantioselective synthesis of S-styrene oxide. In this mechanism, molecular oxygen first reacts with NSMOA(FADred) to yield an FAD C(4a)- peroxide intermediate. This species is non-fluorescent and has an absorbance maximum of 382 nm. Styrene then reacts with the peroxide intermediate with a second order rate constant of 2.6 × 106 ± 0.1 × 106 M−1 s−1 to yield a fluorescent intermediate with an absorbance maximum of 368 nm. We compute an activation free energy of 8.7 kcal.mol∙−1 for the oxygenation step in good agreement with that expected for a peroxide-catalyzed epoxidation, and acid-quenched samples recovered at defined time points in the single-turnover reaction indicate that styrene oxide synthesis is coincident with the formation phase of the fluorescent intermediate. These findings support FAD C(4a)-peroxide as the oxygen atom donor and identity of the fluorescent intermediate as an FAD C(4a)-hydroxide product of the styrene epoxidation. Overall, four pH-dependent rate constants corresponding to peroxyflavin formation (pKa = 7.2), styrene epoxidation (pKa = 7.7), styrene oxide dissociation (pKa = 8.3), and hydroxyflavin dehydration (pKa 7.6) are needed to fit the single-turnover kinetics.
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