Probing Protein Dynamics in Neuronal Nitric Oxide Synthase by Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry.
Probing Protein Dynamics in Neuronal Nitric Oxide Synthase by Quantitative Cross-Linking Mass Spectrometry.
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DOI：
10.1021/acs.biochem.3c00245
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发表时间：
2023-08-01
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Feng, Changjian
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Jiang, Ting;Wan, Guanghua;Zhang, Haikun;Gyawali, Yadav Prasad;Underbakke, Eric S.;Feng, Changjian
一氧化氮合酶（NOS）负责一氧化氮（NO）的生物合成，一氧化氮是一种重要的信号分子，控制着多种生理过程，如神经传递和血管舒张。神经元型一氧化氮合酶（nNOS）是一种受钙调蛋白（CaM）调控的酶。在没有钙调蛋白时，几个nNOS特有的调控元件以及NADP⁺结合会抑制电子在NOS结构域间的转移。钙调蛋白结合可解除抑制因素，促进产生NO所需的电子传递。nNOS调控元件的调节动力学对控制NO信号传导至关重要，但由于NOS的内在动力学阻碍了传统的结构生物学方法，一些机制问题仍然存在。在此，我们利用交联质谱（XL MS）来探究nNOS中的调节动力学，重点关注钙调蛋白响应的调控元件。定量交联揭示了区分单独的nNOS还原酶（nNOSred）、结合NADP⁺的nNOSred、nNOS - 钙调蛋白以及结合NADP⁺的nNOS - 钙调蛋白的构象变化。我们观察到钙调蛋白和NADP⁺对nNOSred交联模式的不同影响。钙调蛋白引起显著的全局变化，而NADP⁺的影响主要局限于NADPH结合亚结构域。此外，钙调蛋白增加了与钙调蛋白 - nNOS间交联形成相关的nNOS内部交联的丰度。综上所述，这些交联质谱结果表明，钙调蛋白和NADP⁺位点特异性地改变了nNOS的构象景观。
Nitric oxide synthase (NOS) is responsible for biosynthesis of nitric oxide (NO), an important signaling molecule controlling diverse physiological processes such as neurotransmission and vasodilation. Neuronal NOS (nNOS) is a calmodulin (CaM)-controlled enzyme. In the absence of CaM, several nNOS-unique control elements, along with NADP+ binding, suppress electron transfer across the NOS domains. CaM binding relieves the inhibitory factors to promote the electron transport required for NO production. The regulatory dynamics of nNOS control elements are critical to governing NO signaling, yet mechanistic questions remain because the intrinsic dynamics of NOS thwart traditional structural biology approaches. Here, we employ cross-linking mass spectrometry (XL MS) to probe regulatory dynamics in nNOS, focusing on the CaM-responsive control elements. Quantitative cross-linking revealed conformational changes differentiating the nNOS reductase (nNOSred) alone, nNOSred with NADP+, nNOS-CaM, and nNOS-CaM with NADP+. We observed distinct effects of CaM vs. NADP+ on cross-linking patterns in nNOSred. CaM induces striking global changes while the impact of NADP+ is primarily localized to the NADPH-binding subdomain. Moreover, CaM increases the abundance of intra-nNOS cross-links that are related to the formation of the inter-CaM-nNOS cross-links. Taken together, these XL MS results demonstrate that CaM and NADP+ site-specifically alter the nNOS conformational landscape.
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