Engineering subtilisin proteases that specifically degrade active RAS.
Engineering subtilisin proteases that specifically degrade active RAS.
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DOI：
10.1038/s42003-021-01818-7
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发表时间：
2021-03-05
影响因子：
5.9
通讯作者：
Bryan PN
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen Y;Toth EA;Ruan B;Choi EJ;Simmerman R;Chen Y;He Y;Wang R;Godoy-Ruiz R;King H;Custer G;Travis Gallagher D;Rozak DA;Solomon M;Muro S;Weber DJ;Orban J;Fuerst TR;Bryan PN
我们描述了工程枯草杆菌蛋白酶的设计，动力学特性和结构，通过切割开关2中的保守序列来降解活性形式的RAS。RAS是一种信号蛋白，当突变时，会导致三分之一的人类癌症。为了产生RAS靶序列的高特异性，将活性位点修饰为依赖于辅因子（咪唑或亚硝酸盐），并将蛋白酶亚位点工程化以在底物和辅因子结合之间产生连接。活性RAS的选择性蛋白水解产生于2步过程，其中亚位点相互作用促进辅因子的生产性结合，从而实现切割。以这种方式工程化的蛋白酶在体外特异性切割活性RAS，消耗细菌报告系统中的RAS水平，并且还降解人细胞培养物中的RAS。虽然这些蛋白酶靶向活性RAS，但基本的设计原则是基本的，并且将适用于许多靶蛋白。Chen等人描述了枯草杆菌蛋白酶突变体的合理设计，其通过切割开关2中的保守序列来降解活性RAS。他们进一步修饰了活性位点，使其依赖于辅因子以产生高靶特异性。被设计用来切割该区域的蛋白酶在体外和细胞中降解RAS，并有望适应其他靶蛋白。
We describe the design, kinetic properties, and structures of engineered subtilisin proteases that degrade the active form of RAS by cleaving a conserved sequence in switch 2. RAS is a signaling protein that, when mutated, drives a third of human cancers. To generate high specificity for the RAS target sequence, the active site was modified to be dependent on a cofactor (imidazole or nitrite) and protease sub-sites were engineered to create a linkage between substrate and cofactor binding. Selective proteolysis of active RAS arises from a 2-step process wherein sub-site interactions promote productive binding of the cofactor, enabling cleavage. Proteases engineered in this way specifically cleave active RAS in vitro, deplete the level of RAS in a bacterial reporter system, and also degrade RAS in human cell culture. Although these proteases target active RAS, the underlying design principles are fundamental and will be adaptable to many target proteins. Chen et al. describe a rational design of subtilisin mutants that degrade active RAS by cleaving a conserved sequence in switch 2. They further modified the active site to be dependent on a cofactor to generate high target specificity. Proteases engineered to cleave this region degraded RAS in vitro and in cells with a promise of adaptability for other target proteins too.
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DOI：
10.1107/s090744491003982x
发表时间：
2011-04
期刊：
Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography
影响因子：
--
作者：
Evans PR
通讯作者：
Evans PR
影响因子：
2.9
作者：
Fisher, Kathryn E.;Ruan, Biao;Bryan, Philip N.
通讯作者：
Bryan, Philip N.
影响因子：
2.9
作者：
BRYAN, P;ALEXANDER, P;GALLAGHER, DT
通讯作者：
GALLAGHER, DT
DOI：
10.1107/s0907444904019158
发表时间：
2004-12-01
影响因子：
2.2
作者：
Emsley, P;Cowtan, K
通讯作者：
Cowtan, K
DOI：
10.1073/pnas.87.12.4849
发表时间：
1990-06-01
影响因子：
11.1
作者：
BRUNGER, AT;MILBURN, MV;KIM, SH
通讯作者：
KIM, SH