Enzymatic activity characterization of SARS coronavirus 3C-like protease by fluorescence resonance energy transfer technique.
Enzymatic activity characterization of SARS coronavirus 3C-like protease by fluorescence resonance energy transfer technique.
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通过荧光共振能量转移技术对SARS冠状病毒3C样蛋白酶的酶促活性表征。
DOI：
10.1111/j.1745-7254.2005.00010.x
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发表时间：
2005-01
影响因子：
8.2
通讯作者：
Jiang HL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen S;Chen LL;Luo HB;Sun T;Chen J;Ye F;Cai JH;Shen JK;Shen X;Jiang HL
研究严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（CoV）3C样蛋白酶（3CLpro）及其4个定点突变体的酶活性。基于荧光共振能量转移（FRET）原理，以5-[（2′-氨乙基）-氨基]萘磺酸（EDANS）和4-[[4-（二甲氨基）苯基]偶氮]苯甲酸（Dabcyl）为能量转移对，设计了一种用于评价SARS冠状病毒3CLpro蛋白水解活性的荧光底物。动力学参数为Km=404 μmol·L−1，kcat=1.08 min−1，kcat/Km=2.7 mmol−1·L·min−1。SARS-CoV 3CLpro显示出实质性的pH和温度触发的活性开关，并且SARS-CoV 3CLpro的定点突变分析显示，His 41、Cys 145和His 163的取代导致酶活性的完全丧失，而用Ala取代Met 162导致活性的强烈增加。本研究为进一步了解SARS病毒3CLpro的催化机制提供了有价值的信息。该方法为SARS-CoV 3CL抑制剂的筛选提供了一种理想的方法。
To characterize enzymatic activity of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus (CoV) 3C-like protease (3CLpro) and its four site-directed mutants. Based on the fluorescence resonance energy transfer (FRET) principle using 5-[(2′-aminoethyl)-amino] naphthelenesulfonic acid (EDANS) and 4-[[4-(dimethylamino) phenyl] azo] benzoic acid (Dabcyl) as the energy transfer pair, one fluorogenic substrate was designed for the evaluation of SARS-CoV 3CLpro proteolytic activity. The kinetic parameters of the fluorogenic substrate have been determined as Km=404 μmol·L−1, kcat=1.08 min−1, and kcat/Km=2.7 mmol−1·L·min−1. SARS-CoV 3CLpro showed substantial pH and temperature-triggered activity switches, and site-directed mutagenesis analysis of SARS-CoV 3CLpro revealed that substitutions of His41, Cys145, and His163 resulted in complete loss of enzymatic activity, while replacement of Met162 with Ala caused strongly increased activity. This present work has provided valuable information for understanding the catalytic mechanism of SARS-CoV 3CLpro. This FRET-based assay might supply an ideal approach for the exploration SARS-CoV 3CLpro putative inhibitors.
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SARS study group
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