Isolation of rare recombinants without using selectable markers for one-step seamless BAC mutagenesis.
Isolation of rare recombinants without using selectable markers for one-step seamless BAC mutagenesis.
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DOI：
10.1038/nmeth.3030
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发表时间：
2014-09
期刊：
影响因子：
48
通讯作者：
Brunelli, Luca
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lyozin, George T.;Bressloff, Paul C.;Kumar, Amit;Kosaka, Yasuhiro;Demarest, Bradley L.;Yost, H. Joseph;Kuehn, Michael R.;Brunelli, Luca
目前的实验室方法分离罕见的（1:10万至1:10万）细菌人工染色体（BAC）重组需要可选择的标记。无缝BAC突变需要两个步骤：使用可选择的标记分离罕见的重组，然后通过反选择去除标记。在这里，我们展示了创始人原理驱动富集（FPE），这是一种简单的方法，可以快速分离罕见的重组，而不使用可选择的标记，允许一步无缝的BAC突变。作为原理证明，我们通过FPE分离出1:10万无缝荧光蛋白修饰的Nodal BAC，并通过产生荧光报告小鼠来证实BAC的功能。我们还分离了小的indel p1噬菌体衍生的人工染色体（PAC）和BAC重组体。统计分析显示，运行<40个pcr可以分离出1:10万重组体，我们开发了一个基于网络的计算器来优化FPE。通过消除对选择-反选择的需要，这项工作强调了一种简单而低成本的BAC诱变方法，为功能基因组学中的无缝重组管道提供了工具。
Current laboratory methods to isolate rare (1:10,000 to 1:100,000) bacterial artificial chromosome (BAC) recombinants require selectable markers. Seamless BAC mutagenesis needs two steps: isolation of rare recombinants using selectable markers, followed by marker removal through counterselection. Here we illustrate founder principle-driven enrichment (FPE), a simple method developed to rapidly isolate rare recombinants without using selectable markers, allowing one-step seamless BAC mutagenesis. As proof-of-principle, we isolated 1:100,000 seamless fluorescent protein-modified Nodal BACs via FPE and confirmed BAC functionality by generating fluorescent reporter mice. We also isolated small indel P1-phage derived artificial chromosome (PAC) and BAC recombinants. Statistical analysis revealed that 1:100,000 recombinants can be isolated running <40 PCRs and we developed a web-based calculator to optimize FPE. By eliminating the need for selection-counterselection, this work highlights a straightforward and low-cost approach to BAC mutagenesis, providing a tool for seamless recombineering pipelines in functional genomics.
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影响因子：
64.8
作者：
Skarnes WC;Rosen B;West AP;Koutsourakis M;Bushell W;Iyer V;Mujica AO;Thomas M;Harrow J;Cox T;Jackson D;Severin J;Biggs P;Fu J;Nefedov M;de Jong PJ;Stewart AF;Bradley A
通讯作者：
Bradley A
影响因子：
5.6
作者：
Sawitzke JA;Costantino N;Li XT;Thomason LC;Bubunenko M;Court C;Court DL
通讯作者：
Court DL
影响因子：
--
作者：
Poteete AR;Fenton AC;Nadkarni A
通讯作者：
Nadkarni A
影响因子：
64.8
作者：
Wang HH;Isaacs FJ;Carr PA;Sun ZZ;Xu G;Forest CR;Church GM
通讯作者：
Church GM
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--