利用酵母双杂交系统筛选与草莓镶脉病毒 P6 蛋白互作的森林草莓寄主因子
利用酵母双杂交系统筛选与草莓镶脉病毒 P6 蛋白互作的森林草莓寄主因子
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DOI：
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发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
江彤
中科院分区：
文献类型：
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作者：
李帅;蒋西子;梁伟芳;陈思涵;张享享;左登攀;胡亚会;江彤
摘要：【目的】草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）是侵染草莓的主要病毒，但其侵染.草莓的机制尚不清楚。论文以 SVBV 的 P6 蛋白为诱饵筛选森林草莓（Fragaria vesca）cDNA 文库的寄主因子，为.解析 SVBV 侵染草莓的分子机制提供理论依据。【方法】SVBV 接种森林草莓，提取出现明显症状叶片的总 RNA，DnaseI.处理后，用 SMART 法反转录合成 ds cDNA，均一化处理 cDNA 并酶切纯化，将＜400 bp 的短片段去除，其余片段连.接到 pGAD-T7 质粒载体上，构建森林草莓初级 cDNA 文库。同时将 SVBV P6 构建到酵母双杂交诱饵载体 pGBK-T7 上，.再将 pGBK-P6 和 pGBK-T7 分别转化酵母菌株 AH109，阳性酵母菌株接种 SD/-Trp 液体培养基，鉴定诱饵载体对酵.母细胞的毒性。将转化 pGBK-P6 的酵母菌分别涂布 SD/-Trp、SD/-Leu-Trp 和 SD/-His-Trp 平板，测定菌落生长情.况，分析 P6 蛋白对酵母报告基因的自激活活性。然后用森林草莓初级 cDNA 文库质粒转化含有诱饵载体 pGBK-P6.的 AH109 酵母菌株，共转化子依次涂布 SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-His 和 SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal 平板，.最终筛选蓝色且长势较好的阳性菌落，提取酵母质粒并测序，GenBank 中初步比对候选基因，利用 Uniprot 在线.网站的 gene ontology（GO）通路注释互作蛋白因子，分析互作蛋白的生物学功能。【结果】3 种 cDNA 文库平均库.容超过 2.0×106 cfu，平均文库重组率为 97%，文库插入片段平均扩增长度＞1 kb，表明森林草莓 cDNA 文库符合.试验标准。最终利用 SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal 培养基筛选得到 230 个酵母阳性克隆，经过序列相似性比对，.除去重复序列、载体序列和移码序列，共筛得 15 个与 SVBV P6 互作的寄主因子。GO 通路注释结果表明这些寄主.因子参与了 13 种生物过程，包括泛素化、转录因子调节、防御反应、代谢过程、氧化还原和胞内氨基酸代谢等过.程；这 15 个寄主因子的分子功能多样，包括乙酰转移酶活性、萜烯合酶活性、脱氢酶活性、金属离子结合活性、.蛋白激酶活性和水解酶活性等。【结论】成功构建了森林草莓酵母 cDNA 文库，筛选出 15 个与 SVBV P6 互作的森林.草莓寄主因子，为进一步探明 SVBV 与森林草莓互作的分子机理提供了理论依据。