LNA modification of single-stranded DNA oligonucleotides allows subtle gene modification in mismatch-repair-proficient cells
LNA modification of single-stranded DNA oligonucleotides allows subtle gene modification in mismatch-repair-proficient cells
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DOI：
10.1073/pnas.1513315113
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发表时间：
2016-04-12
影响因子：
11.1
通讯作者：
te Riele, Hein P. J.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
van Ravesteyn, Thomas W.;Dekker, Marleen;te Riele, Hein P. J.
合成单链 DNA 寡核苷酸 (ssODN) 可用于在真核和原核细胞中产生细微的遗传修饰，而不需要预先产生 DNA 双链断裂。然而，DNA 错配修复 (MMR) 将基因修饰的效率抑制了 100 倍以上。在这里，我们提出了一种市售的 ssODN 设计，它可以逃避 MMR，并能够在 MMR 熟练的细胞中进行微妙的基因修饰。 ssODN 中错配碱基处或直接相邻碱基处存在锁核酸 (LNA)，使得 MMR 熟练的小鼠胚胎干细胞中的 1、2 或 3 bp 替换与 MMR 缺陷细胞中的效果一样有效。此外，在精通 MMR 的大肠杆菌中，ssODN 的 LNA 修饰可实现有效的单碱基对替换。在体外，错配的 LNA 修饰阻止了纯化的大肠杆菌 MMR 蛋白 MutS 的结合。这些发现使得 ssODN 导向的基因修饰特别适合需要评估大量具有易于选择表型的序列变体的应用。
Synthetic single-stranded DNA oligonucleotides (ssODNs) can be used to generate subtle genetic modifications in eukaryotic and prokaryotic cells without the requirement for prior generation of DNA double-stranded breaks. However, DNA mismatch repair (MMR) suppresses the efficiency of gene modification by > 100-fold. Here we present a commercially available ssODN design that evades MMR and enables subtle gene modification in MMR-proficient cells. The presence of locked nucleic acids (LNAs) in the ssODNs at mismatching bases, or also at directly adjacent bases, allowed 1-, 2-, or 3-bp substitutions in MMR-proficient mouse embryonic stem cells as effectively as in MMR-deficient cells. Additionally, in MMR-proficient Escherichia coli, LNA modification of the ssODNs enabled effective single-base-pair substitution. In vitro, LNA modification of mismatches precluded binding of purified E. coli MMR protein MutS. These findings make ssODN-directed gene modification particularly well suited for applications that require the evaluation of a large number of sequence variants with an easy selectable phenotype.