A conditional RNA Pol II mono-promoter drives HIV-inducible, CRISPR-mediated cyclin T1 suppression and HIV inhibition.
A conditional RNA Pol II mono-promoter drives HIV-inducible, CRISPR-mediated cyclin T1 suppression and HIV inhibition.
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DOI：
10.1016/j.omtn.2023.04.011
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发表时间：
2023-06-13
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Unwalla, Hoshang J.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chinnapaiyan, Srinivasan;Santiago, Maria-Jose;Panda, Kingshuk;Rahman, Md. Sohanur;Alluin, Jessica;Rossi, John;Unwalla, Hoshang J.
使用针对 HIV 前病毒 DNA 的成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 进行基因编辑已显示出可从受感染细胞中切除 HIV。然而，基于 CRISPR 的 HIV 切除很容易受到病毒逃逸的影响。针对细胞辅助因子提供了一种有吸引力但有风险的替代方案，可以使病毒逃逸变得无关紧要。 Cyclin T1 是 HIV 转录的关键调节剂，并介导正转录延伸因子-b (P-TEFb) 激酶的募集以实现转录延伸。因此，CRISPR介导的细胞周期蛋白T1失活将沉默HIV转录，将其锁定在细胞中的非活性形式，从而作为有效的抗病毒药物，并可能实现功能性治愈。然而，细胞基因发挥着重要作用，它们不受控制的抑制可能会产生不良影响。在这里，我们展示了基于条件诱导型 RNA 聚合酶 II (RNA Pol II) 单启动子的 CRISPR 系统从单个转录单元靶向细胞周期蛋白 T1 的共表达。指导 RNA (gRNA) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas9) 的共表达仅在 HIV 感染的细胞中观察到，并导致严格的慢性感染细胞系以及 T 细胞系中的 HIV 持续抑制。我们进一步表明，紧邻 gRNA 上游的顺式作用核酶的掺入进一步增强了 HIV 沉默。 HIV 病毒库的大部分具有转录活性，并表达病毒蛋白，这些病毒蛋白是 cART 时代非艾滋病合并症的原因。由于逃逸突变体，针对 HIV RNA/DNA 的方法在很大程度上是无效的。仅在感染 HIV 的细胞中基于 CRISPR 的关键细胞辅助因子失活可以使这些储存库中的 HIV 沉默。
Gene editing using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) targeted to HIV proviral DNA has shown excision of HIV from infected cells. However, CRISPR-based HIV excision is vulnerable to viral escape. Targeting cellular co-factors provides an attractive yet risky alternative to render viral escape irrelevant. Cyclin T1 is a critical modulator of HIV transcription and mediates recruitment of positive transcription elongation factor-b (P-TEFb) kinase for transcriptional elongation. Hence, a CRISPR-mediated cyclin T1 inactivation will silence HIV transcription, locking it in an inactive form in the cell and thereby serving as an effective antiviral and possibly effecting a functional cure. However, cellular genes play important roles, and their uncontrolled inhibition can promote undesirable effects. Here, we demonstrate a conditional inducible RNA polymerase II (RNA Pol II) mono-promoter-based co-expression of a CRISPR system targeting cyclin T1 from a single transcription unit. Co-expression of guide RNA (gRNA) and CRISPR-associated protein (Cas9) is observed only in HIV-infected cells and leads to sustained HIV suppression in stringent chronically infected cell lines as well as in T cell lines. We further show that incorporation of cis-acting ribozymes immediately upstream of the gRNA further enhances HIV silencing. The bulk of the HIV reservoir is transcriptionally active and expresses viral proteins that are responsible for non-AIDS comorbidities in the cART era. Approaches targeting HIV RNA/DNA are largely ineffectual due to escape mutants. CRISPR-based inactivation of critical cellular co-factors only in HIV-infected cells can silence HIV in these reservoirs.
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