Monitoring antigen-specific T cell responses using real-time PCR.
Monitoring antigen-specific T cell responses using real-time PCR.
复制标题
使用实时 PCR 监测抗原特异性 T 细胞反应。
DOI：
10.1007/978-1-4939-1158-5_5
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发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Storkus,WalterJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lowe,DevinB;Taylor,JenniferL;Storkus,WalterJ
基于流式细胞术、ELISA和ELISpot的体外测定在评估感染性疾病和癌症背景下抗原特异性T细胞的频率和功能能力方面发挥了重要作用。这些方法有助于开发用于人类疾病预防/治疗的抗原特异性疫苗，并且还作为基于效应分子的抗原诱导的T细胞表达来监测患者免疫应答的基础（如细胞因子，趋化因子，或与细胞溶解相关的蛋白质）。以下方法概述了采用定量实时PCR（使用SYBR®绿色技术的qRT-PCR）来检测抗原特异性CD 8 +T细胞应答，所述应答基于在用负载肽（抗原）的自体外周血单核细胞（PBMC）体外刺激后它们对IFN-γ mRNA转录的快速上调。当前qRT-PCR方法相对于基于蛋白质的检测方法的优点包括区分针对多种抗原的固有CD 8 +T细胞应答的灵敏度，而不需要人工预扩增离体T细胞数量，后者体外测定系统通常需要。在qRT-PCR设置和运行后，将人IFN-γ转录物的水平标准化为CD 8转录物表达水平，数据报告为该指数相对于用阴性对照肽（例如，HIV NEF）。
Flow cytometry-, ELISA-, and ELISpot-based in vitro assays have played important roles in assessing the frequencies and functional competence of antigen-specific T cells in the setting of infectious disease and cancer. Such methods have helped in the development of antigen-specific vaccines for human disease prevention/treatment and have also served as a foundation for the monitoring of patients’ immune responsiveness based on antigen-induced T cell expression of effector molecules (such as cytokines, chemokines, or proteins associated with cytolysis) as a consequence of therapeutic intervention.The following method outlines a protocol employing quantitative real-time PCR (qRT-PCR) with SYBR®green technology to examine antigen-specific CD8+T cell responses based on their rapid up-regulation of IFN-γ mRNA transcription following in vitro stimulation with peptide (antigen)-loaded, autologous peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The advantages of the current qRT-PCR approach over protein-based detection methods include the sensitivity to distinguish resident CD8+T cell responses against multiple antigens without the need to artificially pre-expand T cell numbers ex vivo, as is commonly required for the latter in vitro assay systems. Following qRT-PCR setup and run, the level of human IFN-γ transcript is normalized to CD8 transcript expression level, with data reported as the relative fold change in this index versus a patient-matched PBMC sample stimulated with a negative control peptide (e.g., HIV NEF).
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