A continuous fluorescence displacement assay for BioA: an enzyme involved in biotin biosynthesis.
A continuous fluorescence displacement assay for BioA: an enzyme involved in biotin biosynthesis.
复制标题
DOI：
10.1016/j.ab.2011.05.003
复制
发表时间：
2011-09-01
影响因子：
2.9
通讯作者：
Aldrich CC
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Wilson DJ;Shi C;Duckworth BP;Muretta JM;Manjunatha U;Sham YY;Thomas DD;Aldrich CC
辅因子生物合成途径代表了潜在抗生素靶点的丰富来源。生物素生物合成的第二步由 BioA 执行，BioA 是一种 5'-磷酸吡哆醛 (PLP) 依赖性酶。该酶已被确认为结核分枝杆菌的候选靶标；然而，目前用于测量 BioA 活性的生物测定方法繁琐且通量低。在这里，我们描述了用于测量 BioA 活性的连续耦合荧光位移测定的设计、开发和优化。在此偶联测定中，BioD 将 BioA 催化反应的产物转化为脱硫生物素，随后通过从链霉亲和素中替换荧光标记的脱硫生物素探针来检测脱硫生物素。该测定进一步适应高通量筛选形式，并针对 LOPAC 文库进行验证。
Cofactor biosynthetic pathways represent a rich source of potential antibiotic targets. The second step in biotin biosynthesis is performed by BioA, a pyridoxal 5′-phosphate (PLP) dependent enzyme. This enzyme has been confirmed as a candidate target in Mycobacterium tuberculosis; however, the current bioassay used to measure BioA activity is cumbersome and low-throughput. Here we describe the design, development and optimization of a continuous coupled fluorescence displacement assay to measure BioA activity. In this coupled assay, BioD converts the product of the BioA–catalyzed reaction into dethiobiotin, which is subsequently detected by displacement of a fluorescently labeled dethiobiotin probe from streptavidin. The assay was further adapted to a high-throughput screening format and validated against the LOPAC library.
登录
查看更多内容
影响因子：
7.3
作者：
McGovern, SL;Helfand, BT;Shoichet, BK
通讯作者：
Shoichet, BK
影响因子：
5.4
作者：
Mann, Stephane;Ploux, Olivier
通讯作者：
Ploux, Olivier
影响因子：
1.8
作者：
Mann, S;Florentin, D;Marquet, A
通讯作者：
Marquet, A
影响因子：
4.7
作者：
Marek, M;Kaiser, K;Gruber, HJ
通讯作者：
Gruber, HJ
影响因子：
1.8
作者：
Liu, J;Ikemoto, N;Armstrong, JD
通讯作者：
Armstrong, JD