麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质
麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质
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DOI：
10.3969/j.issn.2095-1191.2019.05.28
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发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
徐为民
中科院分区：
文献类型：
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作者：
王晶晶;张新笑;卞欢;耿志明;李鹏鹏;王道营;徐为民
【目的】克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。【方法】采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(~(48)Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。【结果】克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(~(48)Sec→ Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DGPx4 。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32 ℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu~(2+)和Ni~(2+)对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg~(2+)和Mn~(2+)对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca~(2+)和Zn~(2+)对DGPx4活力则无明显的促进或抑制作用。【结论】从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。