Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.
Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.
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DOI：
10.2144/000113418
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发表时间：
2010-06
期刊：
影响因子：
2.7
通讯作者：
Matsumura I
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bryksin AV;Matsumura I
在这里，我们描述了一种简单，有效，可靠的方法来克隆插入的选择到一个质粒的选择没有限制性内切酶或T4 DNA连接酶。使用在5′端含有质粒序列和在3′端含有插入序列的嵌合引物来PCR扩增各种大小的插入序列，即GFP（gfp）、β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（gusA）和β-半乳糖苷酶（lacZ）的基因以及整个luxABCDE操纵子。这些插入片段在第二次PCR中用作大引物，使用环状质粒模板。然后用Dpn I在限制性内切酶中破坏原始质粒模板，并将重叠延伸PCR产物用于转化感受态大肠杆菌细胞。扩增和融合反应均使用了双链DNA聚合酶，因此两种反应都易于监控和优化。
Here we describe a straightforward, efficient, and reliable way to clone an insert of choice into a plasmid of choice without restriction endonucleases or T4 DNA ligase. Chimeric primers containing plasmid sequence at the 5′ ends and insert sequence at the 3′ ends were used to PCR-amplify insertion sequences of various sizes, namely the genes for GFP (gfp), β-D-glucuronidase (gusA), and β-galactosidase (lacZ), as well as the entire luxABCDE operon. These inserts were employed as mega-primers in a second PCR with a circular plasmid template. The original plasmid templates were then destroyed in restriction digests with DpnI, and the overlap extension PCR products were used to transform competent Escherichia coli cells. Phusion DNA polymerase was used for the amplification and fusion reactions, so both reactions were easy to monitor and optimize.
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影响因子：
14.9
作者：
Wang, Y;Prosen, DE;Vander Horn, PB
通讯作者：
Vander Horn, PB
影响因子：
7
作者：
Cheo, DL;Titus, SA;Brasch, MA
通讯作者：
Brasch, MA
影响因子：
1.6
作者：
Weeks, Stephen D.;Drinker, Mark;Loll, Patrick J.
通讯作者：
Loll, Patrick J.
DOI：
10.1016/s1044-0305(03)00148-x
发表时间：
2003-06-01
影响因子：
3.2
作者：
Benson, LM;Null, AP;Muddiman, DC
通讯作者：
Muddiman, DC
影响因子：
14.9
作者：
Shevchuk, NA;Bryksin, AV;Ladisch, S
通讯作者：
Ladisch, S