Rational design of novel red-shifted BRET pairs: Platforms for real-time single-chain protease biosensors.
Rational design of novel red-shifted BRET pairs: Platforms for real-time single-chain protease biosensors.
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DOI：
10.1002/btpr.144
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发表时间：
2009-03
影响因子：
2.9
通讯作者：
Piwnica-Worms, David
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gammon, Seth T.;Villalobos, Victor A.;Roshal, Mikhail;Samrakandi, Mustapha;Piwnica-Worms, David
迄今为止，生物发光共振能量转移（BRET）系统主要是使用蓝绿色海肾荧光素酶（Rluc）作为光供体。虽然在许多情况下是有效的，但底物（苯基腔肠素）的费用和不利的生化属性限制了基于Rlux的BRET系统的实用性。在这里，我们报告了一系列新的BRET对的基础上，利用D-胰蛋白酶，导致红移的光子输出，有利的生化属性和增加的功效。我们开发了一种改进的Förster方程来预测最佳BRET荧光素酶供体-荧光团对，并将tdTomato确定为点击甲虫绿色荧光素酶（CBG）的最佳红色荧光团受体。通过在CBG和tdTomato之间插入DEVD接头生成能够实时报告活细胞中的执行者半胱天冬酶活性的原型单链蛋白酶生物传感器，并在体外用重组半胱天冬酶进行验证，并在细胞内用凋亡敏感性和抗性细胞系进行验证。在活细胞纵向研究中观察到高信噪比（~33）和Z′因子（0.85），足以进行高通量筛选。因此，我们说明了一个新的BRET系统的合理设计的一般方法，并提供了一种新的单链BRET蛋白酶生物传感器，是长寿命，红移，并利用D-胰蛋白酶。
Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) systems to date have been dominated by use of blue-green Renilla luciferase (Rluc) as the light donor. While effective in many cases, the expense and unfavorable biochemical attributes of the substrate (phenylcoelenterazine) limit utility of Rluc-based BRET systems. Herein we report a series of novel BRET pairs based on luciferases that utilize D-luciferin, resulting in red-shifted photonic outputs, favorable biochemical attributes and increased efficacy. We developed a modified Förster equation to predict optimal BRET luciferase donor-fluorophore pairs and identified tdTomato as the optimal red fluorophore acceptor for click beetle green luciferase (CBG). A prototypical single-chain protease biosensor, capable of reporting on executioner caspase activity in live cells and in real-time, was generated by inserting a DEVD linker between CBG and tdTomato and validated in vitro with recombinant caspases and in cellulo with apoptosis-sensitive and -resistant cell lines. High signal-to-noise ratios (~33) and Z′ factors (0.85) were observed in live cell longitudinal studies, sufficient for high-throughput screening. Thus, we illustrate a general methodology for the rational design of new BRET systems and provide a novel single chain BRET protease biosensor that is long lived, red-shifted, and utilizes D-luciferin.
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影响因子：
2.9
作者：
Arai, R;Nakagawa, H;Nagamune, T
通讯作者：
Nagamune, T
影响因子：
3.8
作者：
Lambert, JC;Wang, GW;Kang, YJ
通讯作者：
Kang, YJ
DOI：
10.1073/pnas.97.22.11984
发表时间：
2000-10-24
影响因子：
11.1
作者：
Baird, GS;Zacharias, DA;Tsien, RY
通讯作者：
Tsien, RY
影响因子：
3.6
作者：
Ayoub, Mohammed A.;Maurel, Damien;Pin, Jean-Philippe
通讯作者：
Pin, Jean-Philippe
影响因子：
3.7
作者：
Dutta, S;Chiu, YC;Wang, KKW
通讯作者：
Wang, KKW