Incorporation of bridged nucleic acids into CRISPR RNAs improves Cas9 endonuclease specificity.
Incorporation of bridged nucleic acids into CRISPR RNAs improves Cas9 endonuclease specificity.
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DOI：
10.1038/s41467-018-03927-0
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发表时间：
2018-04-13
影响因子：
16.6
通讯作者：
Hubbard BP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Cromwell CR;Sung K;Park J;Krysler AR;Jovel J;Kim SK;Hubbard BP
当将CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于功能遗传学和人类治疗应用时，脱靶DNA切割是最重要的问题。在这里，我们表明，在CRISPR-RNA（crRNA）的特定位置掺入下一代桥接核酸（2′，4 ′-BNANC[N-Me]）以及锁核酸（LNA）广泛地减少了Cas9在体外和细胞中的脱靶DNA切割几个数量级。使用单分子FRET实验，我们表明BNANC掺入减缓了Cas9动力学，并通过诱导脱靶序列的高度动态crRNA-DNA双链体来提高特异性，这缩短了切割能力“拉链”构象中的停留时间。除了描述一种用于提高基于CRISPR/Cas9的基因编辑精度的强大技术外，这项研究还阐明了合成核酸的应用。最小化脱靶效应是CRISPR-Cas9治疗应用的重要关注点。在这里，作者表明，将桥接或锁定核酸并入crRNA中可以改善编辑动力学并减少脱靶切割。
Off-target DNA cleavage is a paramount concern when applying CRISPR-Cas9 gene-editing technology to functional genetics and human therapeutic applications. Here, we show that incorporation of next-generation bridged nucleic acids (2′,4′-BNANC[N-Me]) as well as locked nucleic acids (LNA) at specific locations in CRISPR-RNAs (crRNAs) broadly reduces off-target DNA cleavage by Cas9 in vitro and in cells by several orders of magnitude. Using single-molecule FRET experiments we show that BNANC incorporation slows Cas9 kinetics and improves specificity by inducing a highly dynamic crRNA–DNA duplex for off-target sequences, which shortens dwell time in the cleavage-competent, “zipped” conformation. In addition to describing a robust technique for improving the precision of CRISPR/Cas9-based gene editing, this study illuminates an application of synthetic nucleic acids. Minimizing off-target effects is an important concern for therapeutic applications of CRISPR-Cas9. Here, the authors show that incorporating bridged or locked nucleic acids into crRNA improves editing kinetics and reduces off-target cleavage.
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