CRISPR/Cas9介导的RPSA基因敲除细胞系的建立及其应用
CRISPR/Cas9介导的RPSA基因敲除细胞系的建立及其应用
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DOI：
10.13343/j.cnki.wsxb.20200404
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发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
郑海学
中科院分区：
文献类型：
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作者：
高利利;王聪聪;杨帆;曹伟军;张向乐;刘湘涛;朱紫祥;郑海学
【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立RPSA基因缺失的乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cells,BHK21)细胞系,为开展RPSA调控病毒复制机制研究提供工具;同时,初步探究RPSA对塞内卡病毒复制的影响。【方法】根据GenBank中仓鼠的RPSA基因序列找到产生不同转录本的共同外显子段,设计并合成4对引导RNA (sgRNA),分别构建至PX330载体中;经过筛选选择打靶活性较高的PX330-RPSA-sgRNA2质粒用于后续敲除细胞系构建。将PX330-RPSA-sgRNA2质粒转染BHK21细胞后,通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blot及序列测定检测RPSA基因的敲除。通过Western blot及qPCR分析比较塞内卡病毒在野生型及RPSA基因敲除BHK21细胞中的复制差异。【结果】Western blot检测及序列测序证实了RPSA基因敲除单克隆细胞构建成功。进一步研究发现,塞内卡病毒在RPSA基因敲除细胞中的复制水平明显低于其在野生型BHK21细胞中复制的水平。【结论】成功构建了RPSA基因敲除的BHK21细胞系,首次表明RPSA对塞内卡病毒的复制具有重要作用,为进一步开展RPSA在细胞内调控病毒复制机制研究奠定基础。