山羊溶酶体α-甘露糖苷酶不同结构域片段的制备及酶活性的鉴定
山羊溶酶体α-甘露糖苷酶不同结构域片段的制备及酶活性的鉴定
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DOI：
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
李勤凡
中科院分区：
文献类型：
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作者：
赵一宇;吴莹;赵影;赖毕;李勤凡
为分析溶酶体α-甘露糖苷酶(lysosomalα-mannosidase,LAM)亚基结构与酶活性的关系,分别截短、扩增含有山羊溶酶体α-甘露糖苷酶(CaprahircasLAM,ChLAM)高度保守活性位点的亚基片段ChA、ChC、ChD 和ChT,将其作为目的基因构建酵母表达载体pPIC9K-ChA、pPIC9K-ChC、pPIC9K-ChD和pPIC9K-ChT,线性化后电转至酵母GS115感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和 Westernblot检测蛋白表达,并对表达产物进行 LAM 活性检测。结果显示,毕赤酵母中成功表达了有活性的ChLAMt蛋白,相对分子质量约为90kDa,活性为35U;而ChA、ChC、ChD表达产物不具有酶的活性。ChLAMt酶活性最适温度为45~55℃,最适pH5.5,Zn2+ 和 Ca2+ 对ChLAMt酶活性有促进作用,ChLAMt蛋白与野生型全长编码的ChLAM 蛋白有相似的酶活特性,说明 A、C、D这3个亚基上高度保守的活性位点共同参与酶的催化反应,为ChLAM 的研究提供了资料。.