Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy.
Use of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0195850
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发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Datson NA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Beekman C;Janson AA;Baghat A;van Deutekom JC;Datson NA
杜氏肌营养不良症 (DMD) 是一种神经肌肉疾病，其特征是骨骼肌和心肌进行性无力。这种 X 连锁疾病是由 DMD 基因的开放阅读框破坏突变引起的，导致肌营养不良蛋白强烈减少或完全缺失。为了在旨在纠正疾病主要原因的研究药物临床研究中使用肌营养不良蛋白作为支持性甚至替代生物标志物，可靠地量化 DMD 患者治疗前和治疗后肌肉活检中肌营养不良蛋白表达的能力至关重要。在这里，我们展示了 ProteinSimple 毛细管免疫测定 (Wes) 方法的应用，这是一种无凝胶和无印迹的方法，与传统的蛋白质印迹测定相比，需要更少的样品、抗体和运行时间。我们使用 2 种不同的抗体优化了 Wes 的肌营养不良蛋白定量，发现它在大动态范围内具有高度敏感性、可重复性和定量性。使用健康对照肌肉样品作为参考，α-辅肌动蛋白作为蛋白质负荷/肌肉含量对照，对一组由 31 个健康对照、25 个贝克肌营养不良 (BMD) 样品和 17 个 DMD 样品组成的骨骼肌样品进行 Wes 分析。在健康对照中，肌营养不良蛋白水平在最高和最低肌肉样本之间变化 3 至 5 倍，参考样本代表所有 31 个样本的平均值。在 BMD 肌肉样本中，肌营养不良蛋白水平范围为 10% 至 90%，平均为健康肌肉平均值的 33%，而对于 DMD 样本，平均肌营养不良蛋白水平为 1.3%，为健康肌肉平均值的 0.7% 至 7%。总之，Wes 是一种适合、有效且可靠的抗肌营养不良蛋白表达定量方法，可作为 DMD 临床药物开发中的生物标志物。
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a neuromuscular disease characterized by progressive weakness of the skeletal and cardiac muscles. This X-linked disorder is caused by open reading frame disrupting mutations in the DMD gene, resulting in strong reduction or complete absence of dystrophin protein. In order to use dystrophin as a supportive or even surrogate biomarker in clinical studies on investigational drugs aiming at correcting the primary cause of the disease, the ability to reliably quantify dystrophin expression in muscle biopsies of DMD patients pre- and post-treatment is essential. Here we demonstrate the application of the ProteinSimple capillary immunoassay (Wes) method, a gel- and blot-free method requiring less sample, antibody and time to run than conventional Western blot assay. We optimized dystrophin quantification by Wes using 2 different antibodies and found it to be highly sensitive, reproducible and quantitative over a large dynamic range. Using a healthy control muscle sample as a reference and α-actinin as a protein loading/muscle content control, a panel of skeletal muscle samples consisting of 31 healthy controls, 25 Becker Muscle dystrophy (BMD) and 17 DMD samples was subjected to Wes analysis. In healthy controls dystrophin levels varied 3 to 5-fold between the highest and lowest muscle samples, with the reference sample representing the average of all 31 samples. In BMD muscle samples dystrophin levels ranged from 10% to 90%, with an average of 33% of the healthy muscle average, while for the DMD samples the average dystrophin level was 1.3%, ranging from 0.7% to 7% of the healthy muscle average. In conclusion, Wes is a suitable, efficient and reliable method for quantification of dystrophin expression as a biomarker in DMD clinical drug development.
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