Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.
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DOI：
10.1038/nature24268
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发表时间：
2017-10-19
期刊：
影响因子：
64.8
通讯作者：
Doudna JA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen JS;Dagdas YS;Kleinstiver BP;Welch MM;Sousa AA;Harrington LB;Sternberg SH;Joung JK;Yildiz A;Doudna JA
来自化脓性链球菌 (SpCas9) 的 RNA 引导的 CRISPR-Cas9 核酸酶已被广泛重新用于基因组编辑。高保真度 (SpCas9-HF1) 和增强特异性 (eSpCas9(1.1)) 变体在人类细胞中表现出显着减少的脱靶切割，但目标辨别机制和进一步提高保真度的潜力尚不清楚。通过单分子福斯特共振能量转移 (smFRET) 实验，我们发现 SpCas9-HF1 和 eSpCas9(1.1) 在与不匹配的靶标结合时都会陷入非活动状态。我们发现 Cas9 内的非催化结构域 REC3 可识别靶标互补性并控制 HNH 核酸酶以调节整体催化能力。利用这一观察结果，我们设计了一种新的超精确 Cas9 变体 (HypaCas9)，该变体在不影响人类细胞中的靶向活性的情况下表现出高全基因组特异性。这些结果提供了一个更全面的模型，可以合理化和修改目标识别和核酸酶激活之间的平衡，以实现精确的基因组编辑。
The RNA-guided CRISPR-Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes (SpCas9) has been widely repurposed for genome editing. High-fidelity (SpCas9-HF1) and enhanced specificity (eSpCas9(1.1)) variants exhibit substantially reduced off-target cleavage in human cells, but the mechanism of target discrimination and the potential to further improve fidelity were unknown. Using single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) experiments, we show that both SpCas9-HF1 and eSpCas9(1.1) are trapped in an inactive state when bound to mismatched targets. We find that a non-catalytic domain within Cas9, REC3, recognizes target complementarity and governs the HNH nuclease to regulate overall catalytic competence. Exploiting this observation, we designed a new hyper-accurate Cas9 variant (HypaCas9) that demonstrates high genome-wide specificity without compromising on-target activity in human cells. These results offer a more comprehensive model to rationalize and modify the balance between target recognition and nuclease activation for precision genome editing.
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影响因子：
64.8
作者：
Anders, Carolin;Niewoehner, Ole;Duerst, Alessia;Jinek, Martin
通讯作者：
Jinek, Martin
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46.9
作者：
Tsai, Shengdar Q.;Zheng, Zongli;Nguyen, Nhu T.;Liebers, Matthew;Topkar, Ved V.;Thapar, Vishal;Wyvekens, Nicolas;Khayter, Cyd;Iafrate, A. John;Le, Long P.;Aryee, Martin J.;Joung, J. Keith
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Joung, J. Keith
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作者：
Mali, Prashant;Esvelt, Kevin M.;Church, George M.
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Church, George M.
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Hsu PD;Lander ES;Zhang F
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Zhang F
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Cencic R;Miura H;Malina A;Robert F;Ethier S;Schmeing TM;Dostie J;Pelletier J
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