A CRISPR-del-based pipeline for complete gene knockout in human diploid cells.
A CRISPR-del-based pipeline for complete gene knockout in human diploid cells.
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基于CRISPR-del的管道，用于在人类二倍体细胞中进行完全基因敲除。
DOI：
10.1242/jcs.260000
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发表时间：
2023-03-15
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4
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
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CRISPR/Cas9技术的进步使我们能够通过容易出错的非同源末端连接修复系统在靶位点引入插入删除突变（indels），轻松生成基因敲除细胞系。移码促进插入缺失可以通过产生过早终止密码子来破坏基因功能。然而，越来越多的证据表明，基于插入缺失的基因破坏并不总是会敲除目标基因。在这里，我们建立了 CRISPR-del 的管道，它通过切割两个不同的靶位点诱导大量染色体缺失，从而在人类二倍体细胞中有效地进行“完整”基因敲除。定量分析表明，这种方法的基因删除频率远高于传统的CRISPR-del方法。本研究中证明的删除基因组区域的长度比 95% 的人类蛋白质编码基因的长度还要长。此外，该管道能够产生具有双等位基因癌症相关染色体缺失的模型细胞系。总的来说，这些数据使我们提出 CRISPR-del 管道是一种在人类二倍体细胞中产生“完整”基因敲除细胞系的有效且实用的方法。摘要：通过插入缺失突变 CRISPR 介导的基因破坏并不总能确保完全基因敲除。在这里，我们描述了一种在人类二倍体细胞中产生完整基因敲除细胞系的有效且实用的方法。
The advance of CRISPR/Cas9 technology has enabled us easily to generate gene knockout cell lines by introducing insertion–deletion mutations (indels) at the target site via the error-prone non-homologous end joining repair system. Frameshift-promoting indels can disrupt gene functions by generation of a premature stop codon. However, there is growing evidence that targeted genes are not always knocked out by the indel-based gene disruption. Here, we established a pipeline of CRISPR-del, which induces a large chromosomal deletion by cutting two different target sites, to perform ‘complete’ gene knockout efficiently in human diploid cells. Quantitative analyses show that the frequency of gene deletion with this approach is much higher than that of conventional CRISPR-del methods. The lengths of the deleted genomic regions demonstrated in this study are longer than those of 95% of the human protein-coding genes. Furthermore, the pipeline enabled the generation of a model cell line having a bi-allelic cancer-associated chromosomal deletion. Overall, these data lead us to propose that the CRISPR-del pipeline is an efficient and practical approach for producing ‘complete’ gene knockout cell lines in human diploid cells. Summary: CRISPR-mediated gene disruption via indel mutations does not always ensure a complete gene knockout. Here, we describe an efficient and practical approach for producing complete gene knockout cell lines in human diploid cells.
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