Dystrophin and mini-dystrophin quantification by mass spectrometry in skeletal muscle for gene therapy development in Duchenne muscular dystrophy.
Dystrophin and mini-dystrophin quantification by mass spectrometry in skeletal muscle for gene therapy development in Duchenne muscular dystrophy.
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DOI：
10.1038/s41434-021-00300-7
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发表时间：
2022-11
期刊：
影响因子：
5.1
通讯作者：
Neubert, Hendrik
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Farrokhi, Vahid;Walsh, Jason;Palandra, Joe;Brodfuehrer, Joanne;Caiazzo, Teresa;Owens, Jane;Binks, Michael;Neelakantan, Srividya;Yong, Florence;Dua, Pinky;Le Guiner, Caroline;Neubert, Hendrik
杜氏肌营养不良症（DMD）是由DMD基因突变引起的致死性退行性肌肉疾病，导致蛋白质肌营养不良蛋白严重减少或缺失。旨在增加功能性肌营养不良蛋白（微型肌营养不良蛋白）表达的基因治疗策略正在研究中。准确定量抗肌萎缩蛋白/微型抗肌萎缩蛋白的能力在评估基因转导水平中是必不可少的。我们证明了一种新的肽免疫亲和液相色谱-串联质谱（IA-LC-MS/MS）测定的验证和应用。数据显示，针对非营养不良对照组织（n = 20）的平均值标准化的Becker肌营养不良和DMD组织中的肌营养不良蛋白表达分别为4-84.5%（平均值32%，n = 20）和0.4-24.1%（平均值5%，n = 20）。在DMD大鼠模型中，来自用AAV 9.hCK. Hopti-Dys 3978.spA（一种含有微型肌营养不良蛋白转基因的腺相关病毒载体）处理的肌营养不良蛋白缺陷大鼠的股二头肌组织在给药后6个月显示出微型肌营养不良蛋白表达的剂量依赖性增加，在高剂量下超过野生型肌营养不良蛋白水平。验证数据显示，试验间和试验内精密度≤20%（定量下限[LLOQ]时≤25%），运行间和运行内相对误差在±20%（LLOQ时±25%）范围内。IA-LC-MS/MS准确定量人和临床前物种中的肌营养不良蛋白/微型肌营养不良蛋白，具有足够的灵敏度，可立即应用于临床前/临床试验。
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal, degenerative muscle disorder caused by mutations in the DMD gene, leading to severe reduction or absence of the protein dystrophin. Gene therapy strategies that aim to increase expression of a functional dystrophin protein (mini-dystrophin) are under investigation. The ability to accurately quantify dystrophin/mini-dystrophin is essential in assessing the level of gene transduction. We demonstrated the validation and application of a novel peptide immunoaffinity liquid chromatography–tandem mass spectrometry (IA-LC-MS/MS) assay. Data showed that dystrophin expression in Becker muscular dystrophy and DMD tissues, normalized against the mean of non-dystrophic control tissues (n = 20), was 4–84.5% (mean 32%, n = 20) and 0.4–24.1% (mean 5%, n = 20), respectively. In a DMD rat model, biceps femoris tissue from dystrophin-deficient rats treated with AAV9.hCK.Hopti-Dys3978.spA, an adeno-associated virus vector containing a mini-dystrophin transgene, showed a dose-dependent increase in mini-dystrophin expression at 6 months post-dose, exceeding wildtype dystrophin levels at high doses. Validation data showed that inter- and intra-assay precision were ≤20% (≤25% at the lower limit of quantification [LLOQ]) and inter- and intra-run relative error was within ±20% (±25% at LLOQ). IA-LC-MS/MS accurately quantifies dystrophin/mini-dystrophin in human and preclinical species with sufficient sensitivity for immediate application in preclinical/clinical trials.
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