单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻 土微生物组的技术比较
单细胞、显微计数和高通量测序典型水稻 土微生物组的技术比较
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发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
杜文斌
中科院分区：
文献类型：
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作者：
贾仲君;蔡元锋;贠娟莉;杜文斌
【目的】比较传统显微计数、单细胞分选和现代分子方法研究.典型水稻土微生物组的细胞数量、物种组成及好氧甲烷氧化菌生理.生态过程的技术特点。【方法】针对水稻土中可提取微生物细胞(土.壤细胞)及其 DNA (细胞 DNA)、单细胞 DNA、土壤微生物组总.DNA (土壤 DNA)，利用传统显微计数和实时荧光定量 PCR (qPCR).方法，研究水稻土好氧甲烷氧化过程中微生物数量的变化规律；通.过高通量测序 16S rRNA 基因技术，研究微生物物种组成的变化规.律。【结果】水稻土微生物组的传统显微计数结果显著低于现代分子.方法 qPCR，最高可达 3 个数量级。基于 DAPI 染色、CARD-FISH、.细胞 DNA 及土壤 DNA 的 qPCR 定量结果分别为：(5.8–7.4)×107、.(1.7–1.9)×107、(2.8–6.3)×108、(1.5–2.7)×1010 cells/g。基于 qPCR 的.水稻土好氧甲烷氧化菌数量为 1.1×107 cells/g，比传统显微计数方法.高 3 个数量级。然而，当水稻土氧化高浓度甲烷后，所有方法均发.现甲烷氧化菌显著增加，增幅分别为 54 倍(CARD-FISH)、388 倍(细.胞 DNA)和 45 倍(土壤 DNA)。在微生物分类学门的水平，细胞 DNA.(25 个门)与土壤 DNA (30 个门)结果基本一致，均能较好地反映水稻.土微生物组的群落结构，而单细胞 DNA 尽管检测到 20 个门，但偏.好性较大，95%以上均为 Proteobacteria。在微生物分类学属的水平，土壤 DNA、细胞 DNA 和单细胞 DNA 分析均表明背景土壤含有 7 个好氧甲烷氧化菌的 pmoA 基因型，.但氧化高浓度甲烷后，γ-Proteobacteria 的 2 个属 Methylobacter/Methylosarcina 则成为优势类群。【结论】.土壤微生物的传统显微计数(DAPI 和 CARD-FISH)结果显著低于 qPCR 技术，相差 1–3 个数量级。qPCR.定量土壤 DNA 和细胞 DNA 表明：水稻土可提取微生物细胞约占土壤微生物总量的 2%左右，而好氧甲.烷氧化菌的提取效率最高可达 6%。细胞 DNA 在门水平能较好地反映水稻土微生物组成，但在属水平.和土壤 DNA 有着较大差异。Planctomycetes 微生物门的细胞易被提取，Acidobacteria 门的微生物则较.难被提取，而单细胞分选技术则偏好 Proteobacteria。尽管传统方法和分子技术的分辨率明显不同，但均.能较好地表征水稻土甲烷氧化的微生物生理生态过程。未来土壤微生物组研究应更加重视科学问题本身.对技术手段的内在需求，最大限度发挥各种先进技术的优势。