Expression and purification of functional insulin and insulin-like growth factor 1 holoreceptors from mammalian cells.
Expression and purification of functional insulin and insulin-like growth factor 1 holoreceptors from mammalian cells.
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DOI：
10.1016/j.ab.2017.08.011
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发表时间：
2017-11-01
影响因子：
2.9
通讯作者：
Miller WT
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Delle Bovi RJ;Miller WT
胰岛素受体（IR）和胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）是受体酪氨酸激酶（RTKs），参与调控许多重要的细胞过程。目前提出的激活模型来源于使用可溶性胞外结构域和细胞质酪氨酸激酶结构域的结构研究。由于需要非常规亲和层析树脂和/或苛刻的洗脱条件，全长IR和IGF1R的制备一直受到阻碍。在这里，我们提出了一种纯化方案，以获得全长，洗涤剂溶解的IR和IGF1R，其数量适合生化和结构表征。我们筛选了一组24种结构不同的洗涤剂，以获得最佳的配体激活。用n-十二烷基-β- d-麦芽糖苷纯化的受体表现出配体刺激的自磷酸化和激酶活性，表明其具有完整的跨膜信号机制。这种方便的纯化方案可用于生产大量的IR， IGF1R或其他rtk，并可适用于其他具有挑战性的膜蛋白。
The insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) are receptor tyrosine kinases (RTKs) involved in the regulation of many important cellular processes. The current proposed models of activation are derived from structural studies using soluble extracellular domains and cytoplasmic tyrosine kinase domains. Preparations of full length IR and IGF1R have been hampered by the need for unconventional affinity chromatography resins and/or harsh eluting conditions. Here, we present a purification protocol to obtain full-length, detergent solubilized IR and IGF1R at quantities suitable for biochemical and structural characterization. We screened a panel of 24 structurally diverse detergents for optimal ligand activation. The receptors purified in n-dodecyl-β-D-maltoside showed ligand-stimulated autophosphorylation and kinase activity, suggesting an intact transmembrane signaling mechanism. This convenient purification protocol can be used to produce high quantities of IR, IGF1R, or other RTKs, and can be adapted for other challenging membrane proteins.
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