鸡LncBMP4编码小肽EPC5的生物信息学分析和多克隆抗体制备
鸡LncBMP4编码小肽EPC5的生物信息学分析和多克隆抗体制备
复制标题
DOI：
10.3969/j.issn.1674-7968.2023.03.019
复制
发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
左其生
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
夏钱;龚威;金晶;张晨;高晓敏;陈晨;周舒简;胡菜;张玉;李碧春;左其生
鸡(Gallus gallus)原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)在转基因动物制备和种质资源保护领域具有广泛应用前景,为了解析鸡PGCs形成的分子机制,本研究前期鉴定了1个调节鸡PGCs形成的关键长链非编码RNA-骨形成蛋白(long noncoding RNA-bone morphogenetic protein 4,LncBMP4),可编码小肽EPC5 (expression in primordial germ cells chromosome 5)。本研究通过在线预测软件初步分析EPC5小肽的化学结构并进行初步的亚细胞定位。通过化学合成法构建PET-EPC5-His-B2M原核融合表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL2感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside,IPTG)诱导后大量表达和纯化EPC5抗原。利用纯化的抗原进行动物免疫并收集抗血清(G1480,G1481),通过ELISA检测抗血清效价。纯化抗体并通过Western blot进行鉴定。结果表明,EPC5主要定位于细胞内并具有RNA聚合酶亚基。成功构建PET-EPC5-His-B2M载体,且诱导表达后重组蛋白大小约为25 kD。ELISA检测发现G1480抗血清效价为1∶5.12×10~5 (OD_(抗血清)/OD_(免前血)≥2.1),G1481抗血清效价为1∶1.024×10~6 (OD_(抗血清)/OD_(免前血)≥2.1)。对G1480抗血清进行纯化,产生的EPC5多克隆抗体浓度为10 mg/mL,ELISA检测显示效价为9.8 ng/mL时(OD_(450)>0.2)。Western blot检测结果显示制备的多克隆抗体可以特异性结合体内外表达的EPC5蛋白。本研究成功地制备EPC5多克隆抗体,为进一步研究EPC5在PGCs形成过程中的功能和机制提供了基础。