小鼠NR1D1基因过表达载体的构建及其生物信息学分析-猫眼课题宝

DOI：

10.13481/j.1671-587x.20220112

发表时间：

2022

期刊：

吉林大学学报(医学版)

影响因子：

通讯作者：

中科院分区：

其他

文献类型：

作者：

董浩;江海圳;李超;高登科;靳亚平;陈华涛

目的：构建小鼠核受体亚家族 1 组 D 成员 1 （NR1D1）基因的过表达载体，分析小鼠NR1D1 蛋白的基本特征。方法：从小鼠肝脏组织中提取总 RNA，反转录后获得 cDNA，采用 PCR 技术扩增得到小鼠 NR1D1 基因的编码区片段，经同源重组与 pcDNA3. 1 载体相连接，将酶切鉴定和测序正确的重组质粒命名为 pcDNA3. 1-NR1D1。将 pcDNA3. 1 空质粒和 pcDNA3. 1-NR1D1 重组质粒分别转染至 HEK293T 细胞中，分别为对照组和 pcDNA3. 1-NR1D1 转染组，48 h 后提取总 RNA 和总蛋白样品，通过实时荧光定量 PCR （RT-qPCR）和 Western blotting 法检测 2 组细胞中 NR1D1 mRNA 和蛋白表达水平。使用 DNAStar 和 MEGA7 软件对小鼠与其他物种的 NR1D1 基因编码区序列（CDS）进行相似性分析，并构建系统进化树；利用 ExPASy、 ProtScale、 SingalP5. 0、 TMHMM-2. 0、PhosphoSitePlus®、SOPMA 和 SWISS-MODEL 等在线工具分析 NR1D1 蛋白的氨基酸组成、亲/疏水性、跨膜区域、信号肽、二级结构和三级结构。结果：酶切鉴定和测序结果均表明过表达载体pcDNA3. 1-NR1D1 构建成功。与对照组比较，pcDNA3. 1-NR1D1 转染组细胞中 NR1D1 mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P<0. 01）。生物信息学分析，小鼠 NR1D1 CDS 区与人、大鼠、中国仓鼠、黑猩猩、兔、犬、猪、马、牛、绵羊、山羊、家猫和斑马鱼的相似性分别为 90. 0%、94. 8%、86. 5%、90. 0%、89. 6%、88. 3%、89. 7%、89. 8%、88. 8%、89. 1%、89. 1%、89. 7% 和 65. 1%。系统进化树分析，小鼠 NR1D1 基因与中国仓鼠和大鼠的遗传距离最近，与斑马鱼的遗传距离最远。小鼠NR1D1 蛋白是一种疏水性碱性蛋白质，不属于分泌蛋白和跨膜蛋白，含有 12 个磷酸化位点和 10 个泛素化位点；二级结构中无规则卷曲占 54. 63%， α -螺旋占 26. 50%，延伸链占 12. 68%， β -转角占6. 18%；三级结构预测，小鼠与人的 NR1D1 蛋白相似度大，差异较小。结论：成功构建了小鼠NR1D1 基因过表达载体 pcDNA3. 1-NR1D1，验证了其在 HEK293T 细胞中的过表达效果，为进一步研究 NR1D1 基因及其蛋白的功能提供了依据。

小鼠NR1D1基因过表达载体的构建及其生物信息学分析

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