The G protein alpha s subunit incorporates [3H]palmitic acid and mutation of cysteine-3 prevents this modification.
The G protein alpha s subunit incorporates [3H]palmitic acid and mutation of cysteine-3 prevents this modification.
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G 蛋白 α s 亚基包含 [3H] 棕榈酸，半胱氨酸 3 的突变阻止了这种修饰。
作者：
M. Y. Degtyarev;Allen M. Spiegel;Teresa L. Z. Jones
我们通过将野生型、长型αS基因导入COS细胞，并用[~3H]棕榈酸或[35S]蛋氨酸进行代谢性标记，研究了αS能否被棕榈酸酯酰化。将细胞分离成颗粒和可溶性部分，并用特异性多肽抗体进行免疫沉淀。[~3H]棕榈酸酯同时掺入内源性和转染型α-S中，用放线菌酮抑制蛋白质合成并不能阻断[~3H]-棕榈酸酯标记α-S的作用。羟胺处理引起氚放射性标记的释放，表明结合是通过硫代酯键进行的。在薄层层析上，氚标记是不稳定的，并与[~3H]棕榈酸酯共迁移。通过定点突变，野生型αS的第三个残基从半胱氨酸突变为丙氨酸。该突变体在COS细胞中表达，并通过[35S]蛋氨酸标记细胞的免疫沉淀确定其定位于颗粒组分。半胱氨酸-3突变体没有经过[~3H]棕榈酸酯的放射性标记，这表明该残基对修饰至关重要。
We investigated whether alpha s could be acylated by palmitate by transfecting COS cells with the cDNA for the wild-type, long form of alpha s and metabolically labeling with [3H]palmitate or [35S]methionine. Cells were separated into particulate and soluble fractions and immunoprecipitated with a specific peptide antibody. [3H]Palmitate was incorporated into both endogenous and transfected alpha s. Inhibition of protein synthesis with cycloheximide did not block the radiolabeling of alpha s with [3H]palmitate. Hydroxylamine treatment caused a release of the tritium radiolabel, demonstrating that the incorporation was through a thioester bond. The tritium radiolabel was base-labile and comigrated with [3H]palmitate on thin-layer chromatography. The third residue of the wild-type alpha s was mutated from a cysteine to an alanine by site-directed mutagenesis. This mutant was expressed in COS cells and localized to the particulate fraction as determined by immunoprecipitation of the [35S]methionine-labeled cells. The cysteine-3 mutant did not undergo radiolabeling with [3H]palmitate, indicating that this residue is crucial for the modification.
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通讯作者：
B. O'dowd;M. Hnatowich;M. Caron;R. Lefkowitz;M. Bouvier