Non-uniform dystrophin re-expression after CRISPR-mediated exon excision in the dystrophin/utrophin double-knockout mouse model of DMD.
Non-uniform dystrophin re-expression after CRISPR-mediated exon excision in the dystrophin/utrophin double-knockout mouse model of DMD.
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在肌营养不良蛋白/肌营养不良蛋白双敲除小鼠DMD模型中，crispr介导的外显子切除后肌营养不良蛋白的不均匀再表达。
DOI：
10.1016/j.omtn.2022.10.010
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发表时间：
2022-12-13
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Roberts, Thomas C.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hanson, Britt;Stenler, Sofia;Ahlskog, Nina;Chwalenia, Katarzyna;Svrzikapa, Nenad;Coenen-Stass, Anna M. L.;Weinberg, Marc S.;Wood, Matthew J. A.;Roberts, Thomas C.
杜氏肌营养不良症 (DMD) 是影响儿童的最常见的遗传性肌病，由编码肌营养不良蛋白的基因遗传缺失引起。在这里，我们研究了金黄色葡萄球菌 CRISPR-Cas9 系统和双切割策略的使用，使用一对腺相关病毒血清型 9 (AAV9) 载体传递，在严重受影响的肌营养不良蛋白/肌营养不良蛋白双敲除 (dKO) 小鼠中恢复肌营养不良蛋白。单引导RNA被设计用于切除Dmd外显子23，侧翼内含子区域通过非同源末端连接修复。通过 PCR 和 Sanger 测序在 DNA 水平上确认外显子 23 缺失，并通过 RT-qPCR 在 RNA 水平上确认。通过腹膜内或静脉内递送途径治疗的小鼠中的蛋白质印迹和免疫荧光染色证明肌营养不良蛋白表达的恢复。肌营养不良蛋白修复在膈肌中最为有效，观察到最多 5.7% 的野生型肌营养不良蛋白表达。 CRISPR 治疗不足以延长 dKO 小鼠的寿命，并且肌营养不良蛋白在骨骼肌组织中以纤维内斑片的方式表达。进一步分析揭示了大量非生产性 DNA 修复事件，包括 CRISPR 切割位点的 AAV 基因组整合。这项研究强调了在 DMD 背景下成功开发 CRISPR 疗法的潜在挑战。 CRISPR-Cas9 介导的外显子切除导致严重受影响的肌营养不良蛋白/肌营养不良蛋白缺失 (dKO) 小鼠中肌营养不良蛋白重新表达。治疗不足以延长寿命，并且肌营养不良蛋白在治疗的骨骼肌组织中以纤维内斑片的方式表达。通过长读长测序检测到大量非生产性编辑事件（包括载体基因组整合）。
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most prevalent inherited myopathy affecting children, caused by genetic loss of the gene encoding the dystrophin protein. Here we have investigated the use of the Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 system and a double-cut strategy, delivered using a pair of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vectors, for dystrophin restoration in the severely affected dystrophin/utrophin double-knockout (dKO) mouse. Single guide RNAs were designed to excise Dmd exon 23, with flanking intronic regions repaired by non-homologous end joining. Exon 23 deletion was confirmed at the DNA level by PCR and Sanger sequencing, and at the RNA level by RT-qPCR. Restoration of dystrophin protein expression was demonstrated by western blot and immunofluorescence staining in mice treated via either intraperitoneal or intravenous routes of delivery. Dystrophin restoration was most effective in the diaphragm, where a maximum of 5.7% of wild-type dystrophin expression was observed. CRISPR treatment was insufficient to extend lifespan in the dKO mouse, and dystrophin was expressed in a within-fiber patchy manner in skeletal muscle tissues. Further analysis revealed a plethora of non-productive DNA repair events, including AAV genome integration at the CRISPR cut sites. This study highlights potential challenges for the successful development of CRISPR therapies in the context of DMD. CRISPR-Cas9-mediated exon excision resulted in dystrophin re-expression in the severely affected dystrophin/utrophin-null (dKO) mouse. Treatment was insufficient to extend lifespan, and dystrophin was expressed in a within-fiber patchy manner in treated skeletal muscle tissues. A plethora of non-productive editing events (including vector genome integration) were detected by long-read sequencing.
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