Investigating protein-protein interactions in living cells using fluorescence lifetime imaging microscopy.
Investigating protein-protein interactions in living cells using fluorescence lifetime imaging microscopy.
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使用荧光寿命成像显微镜研究活细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
DOI：
10.1038/nprot.2011.364
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发表时间：
2011-08-11
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
荧光寿命成像显微镜（FLIM）现在通常用于动态测量活细胞内的信号事件，包括检测蛋白质-蛋白质相互作用。使用这种技术需要了解荧光寿命测量的基本物理。在该协议中，我们描述了时间相关单光子计数和频域方法FLIM数据采集和分析。我们描述了两个FLIM系统的校准，并演示了它们是如何被用来测量猝灭供体荧光寿命，结果从福斯特共振能量转移（FRET）。然后，我们展示了如何使用FLIM-FRET方法来检测活小鼠垂体细胞核中转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-α的二聚化。值得注意的是，所需的因素，准确的测定和重现性的寿命测量。无论使用哪种方法，整个方案（包括标本制备、成像和数据分析）都需要约2天。
Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is now routinely used for dynamic measurements of signaling events inside living cells, including detection of protein-protein interactions. An understanding of the basic physics of fluorescence lifetime measurements is required to use this technique. In this protocol, we describe both the time-correlated single photon counting and the frequency-domain methods for FLIM data acquisition and analysis. We describe calibration of both FLIM systems, and demonstrate how they are used to measure the quenched donor fluorescence lifetime that results from Förster resonance energy transfer (FRET ). We then show how the FLIM-FRET methods are used to detect the dimerization of the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein-α in live mouse pituitary cell nuclei. Notably, the factors required for accurate determination and reproducibility of lifetime measurements are described. With either method, the entire protocol including specimen preparation, imaging and data analysis takes ~2 d.
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