Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.
Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.
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DOI：
10.1038/nprot.2018.012
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发表时间：
2018-06
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
He L
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Modzelewski AJ;Chen S;Willis BJ;Lloyd KCK;Wood JA;He L
CRISPR/Cas9技术以前所未有的精度、效率和易用性改变了小鼠基因组编辑；然而，目前将CRISPR试剂微注射到原核阶段胚胎的做法仍然是有限的。因此，我们开发了CRISPR - ez （CRISPR RNP受精卵电穿孔），这是一种基于电穿孔的技术，在效率、简单性、成本和吞吐量方面优于原核和细胞质微注射。在C57BL/6J和C57BL/6N小鼠品系中，CRISPR-EZ实现了Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNPs）的100%递送，促进了indel突变（插入或缺失）、外显子缺失、点突变和小插入。在高通量敲除小鼠项目（KOMP）管道中的并排比较中，CRISPR-EZ的表现始终优于微注射。在这里，我们提供了一个优化的方案，包括单导RNA （sgRNA）合成，胚胎收集，RNP电穿孔，小鼠生成和基因分型策略。使用CRISPR-EZ，具有基本胚胎操作技能的研究生水平的研究人员可以在6周内获得转基因小鼠。总之，CRISPR-EZ是一种简单、经济、高效和高通量的技术，可能适用于其他哺乳动物物种。
CRISPR/Cas9 technology has transformed mouse genome editing with unprecedented precision, efficiency, and ease; however, the current practice of microinjecting CRISPR reagents into pronuclear-stage embryos remains rate-limiting. We thus developed CRISRP-EZ (CRISPR RNP Electroporation of Zygotes), an electroporation-based technology that outperforms pronuclear and cytoplasmic microinjection in efficiency, simplicity, cost, and throughput. In C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains, CRISPR-EZ achieves 100% delivery of Cas9/sgRNA ribonucleoproteins (RNPs), facilitating indel mutations (insertions or deletions), exon deletions, point mutations, and small insertions. In a side-by-side comparison in the high-throughput KnockOut Mouse Project (KOMP) pipeline, CRISPR-EZ consistently outperformed microinjection. Here, we provide an optimized protocol covering single guide RNA (sgRNA) synthesis, embryo collection, RNP electroporation, mouse generation, and genotyping strategies. Using CRISPR-EZ, a graduate-level researcher with basic embryo manipulation skills can obtain genetically modified mice in 6 weeks. Altogether, CRISPR-EZ is a simple, economic, efficient, and high-throughput technology that is potentially applicable to other mammalian species.
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