Establishment of a novel fluorescence-based method to evaluate chaperone-mediated autophagy in a single neuron.
Establishment of a novel fluorescence-based method to evaluate chaperone-mediated autophagy in a single neuron.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0031232
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发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Sakai N
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Seki T;Yoshino KI;Tanaka S;Dohi E;Onji T;Yamamoto K;Hide I;Paulson HL;Saito N;Sakai N
分子伴侣介导的自噬（CMA）是一种选择性自噬-溶酶体蛋白降解途径。 CMA 在正常神经元功能和神经疾病发病机制中的作用仍不清楚，部分原因是没有可用的方法在单细胞水平上监测 CMA 活性。我们试图通过使用 HaloTag (HT) 系统可视化 CMA 底物从细胞质到溶酶体的易位来建立一种单细胞监测方法。 GAPDH，一种 CMA 底物，与 HT 融合（GAPDH-HT）；在用荧光染料结合的 HT 配体标记后，这种蛋白质在 HeLa 细胞和培养的小脑浦肯野细胞 (PC) 的溶酶体中积累。激活 CMA 的治疗可增强溶酶体积累，而 siRNA 介导的 LAMP2A（CMA 溶酶体受体）敲低和灭活 CMA 的治疗可防止溶酶体积累。这些结果表明，GAPDH-HT 的溶酶体积累反映了 CMA 活性。使用这种方法，我们发现，导致 14 型脊髓小脑共济失调的突变 γPKC 降低了培养 PC 中的 CMA 活性。在本研究中，我们建立了一种新的基于荧光的方法来评估单个神经元的 CMA 活性。这种新方法对于评估 CMA 在各种神经元功能和神经疾病发病机制中的作用应该是有用和有价值的。
Chaperone-mediated autophagy (CMA) is a selective autophagy-lysosome protein degradation pathway. The role of CMA in normal neuronal functions and in neural disease pathogenesis remains unclear, in part because there is no available method to monitor CMA activity at the single-cell level. We sought to establish a single-cell monitoring method by visualizing translocation of CMA substrates from the cytosol to lysosomes using the HaloTag (HT) system. GAPDH, a CMA substrate, was fused to HT (GAPDH-HT); this protein accumulated in the lysosomes of HeLa cells and cultured cerebellar Purkinje cells (PCs) after labeling with fluorescent dye-conjugated HT ligand. Lysosomal accumulation was enhanced by treatments that activate CMA and prevented by siRNA-mediated knockdown of LAMP2A, a lysosomal receptor for CMA, and by treatments that inactivate CMA. These results suggest that lysosomal accumulation of GAPDH-HT reflects CMA activity. Using this method, we revealed that mutant γPKC, which causes spinocerebellar ataxia type 14, decreased CMA activity in cultured PCs. In the present study, we established a novel fluorescent-based method to evaluate CMA activity in a single neuron. This novel method should be useful and valuable for evaluating the role of CMA in various neuronal functions and neural disease pathogenesis.
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影响因子：
13.3
作者：
Finn, Patrick E.;Mesires, Nicholas T.;Dice, J. Fred
通讯作者：
Dice, J. Fred
DOI：
10.1083/jcb.152.4.657
发表时间：
2001-02-19
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Mizushima N;Yamamoto A;Hatano M;Kobayashi Y;Kabeya Y;Suzuki K;Tokuhisa T;Ohsumi Y;Yoshimori T
通讯作者：
Yoshimori T
影响因子：
--
作者：
Alvarez-Erviti, Lydia;Rodriguez-Oroz, Maria C.;Schapira, Anthony H. V.
通讯作者：
Schapira, Anthony H. V.
影响因子：
3.3
作者：
Mizushima, N;Yamamoto, A;Ohsumi, Y
通讯作者：
Ohsumi, Y
影响因子：
16
作者：
Bandyopadhyay U;Sridhar S;Kaushik S;Kiffin R;Cuervo AM
通讯作者：
Cuervo AM