Probing ion channel macromolecular interactions using fluorescence resonance energy transfer.
Probing ion channel macromolecular interactions using fluorescence resonance energy transfer.
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DOI：
10.1016/bs.mie.2021.01.047
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发表时间：
2021
影响因子：
--
通讯作者：
Ben-Johny M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Rivas S;Hanif K;Chakouri N;Ben-Johny M
离子通道是一种大分子复合物，其功能通过相互作用的蛋白质进行精确调节。荧光共振能量转移（FRET）是一种强大的方法，擅长于定量活细胞中离子通道蛋白质-蛋白质相互作用。对于FRET实验，用适当的供体和受体荧光蛋白标记相互作用的配偶体。如果荧光标记的分子非常接近，则供体的光激发导致非辐射能量转移到受体，随后受体发射荧光。离子通道相互作用的化学计量及其相对结合亲和力可以通过定量FRET效率和给定细胞中供体和受体的总数来推导。在这一章中，我们将讨论FRET分析的生物相互作用，各种估计FRET效率的策略，以及详细的协议建设的结合曲线和化学计量测定的一般考虑。我们专注于使用流式细胞仪进行FRET检测，因为它具有高通量数据采集、增强的可访问性和强大的分析能力。这种通用的方法允许在离子通道相互作用的动态变化的机械解剖。
Ion channels are macromolecular complexes whose function is exquisitely tuned by interacting proteins. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) is a powerful methodology that is adept at quantifying ion channel protein-protein interactions in living cells. For FRET experiments, the interacting partners are tagged with appropriate donor and acceptor fluorescent proteins. If the fluorescently-labeled molecules are in close proximity, then photoexcitation of the donor results in non-radiative energy transfer to the acceptor, and subsequent fluorescence emission of the acceptor. The stoichiometry of ion channel interactions and their relative binding affinities can be deduced by quantifying both the FRET efficiency and the total number of donors and acceptors in a given cell. In this chapter, we discuss general considerations for FRET analysis of biological interactions, various strategies for estimating FRET efficiencies, and detailed protocols for construction of binding curves and determination of stoichiometry. We focus on implementation of FRET assays using a flow cytometer given its amenability for high-throughput data acquisition, enhanced accessibility, and robust analysis. This versatile methodology permits mechanistic dissection of dynamic changes in ion channel interactions.
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DOI：
10.1073/pnas.0907866106
发表时间：
2009-12-29
影响因子：
11.1
作者：
Dertinger, T.;Colyer, R.;Enderlein, J.
通讯作者：
Enderlein, J.
影响因子：
3.5
作者：
Chen, Huanmian;Puhl, Henry L., III;Ikeda, Stephen R.
通讯作者：
Ikeda, Stephen R.
影响因子：
64.8
作者：
Glauner, KS;Mannuzzu, LM;Isacoff, EY
通讯作者：
Isacoff, EY
影响因子：
48
作者：
Algar, W. Russ;Hildebrandt, Niko;Medintz, Igor L.
通讯作者：
Medintz, Igor L.
影响因子：
2.4
作者：
FORSTER, T
通讯作者：
FORSTER, T