Hydrophobic pairwise interactions stabilize α-conotoxin MI in the muscle acetylcholine receptor binding site
Hydrophobic pairwise interactions stabilize α-conotoxin MI in the muscle acetylcholine receptor binding site
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DOI：
10.1074/jbc.275.17.12692
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发表时间：
2000-04-28
影响因子：
4.8
通讯作者：
Sine, SM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bren, N;Sine, SM
目前的工作描述了 α-芋螺毒素 MI (CTx MI) 对肌肉乙酰胆碱受体 (AChR) α-δ 位点纳摩尔亲和力的成对相互作用。我们突变了 CTx MI 中的所有非半胱氨酸残基，在 293 个人胚胎肾细胞中表达 AChR 的 α(2)β δ(2) 五聚体形式，并通过与 I-125-α-银环蛇毒素结合的初始速率竞争来测量突变毒素的结合。 CTx MI 突变 P6G、A7V、G9S 和 Y12T 均将 alpha(2)beta delta(2) 五聚体的亲和力降低 10,000 倍。这四个位置的侧链定位于 CTx MI 已知三维结构的限制区域。 AChR 突变揭示了 α 亚基中的 Tyr-198 以及 delta 亚基中的选择性决定簇 Ser-36、Tyr-113 和 Ile-178 对 CTx MI 亲和力的主要贡献。通过使用双突变循环分析，我们发现 CTx MI 的 Tyr-12 与 delta 亚基中的所有三个选择性决定簇强烈相互作用，并且 delta Ser-36 和 delta Ile-178 在稳定 Tyr-12 方面相互依赖。我们发现 CTx MI 中的 Gly-9 和 Pro-6 与 delta 亚基中的选择性决定簇之间以及 Delta 亚基中的 Ala-7 和 Pro-6 和 Tyr-198 之间存在额外的强相互作用。 α亚基。总体结果揭示了 CTx MI 与 α-δ 界面结合时的方向，并表明主要是疏水相互作用稳定了复合物。
The present work delineates pairwise interactions underlying the nanomolar affinity of alpha-conotoxin MI (CTx MI) for the alpha-delta site of the muscle acetylcholine receptor (AChR). We mutated all non-cysteine residues in CTx MI, expressed the alpha(2)beta delta(2) pentameric form of the AChR in 293 human embryonic kidney cells, and measured binding of the mutant toxins by competition against the initial rate of I-125-alpha-bungarotoxin binding. The CTx MI mutations P6G, A7V, G9S, and Y12T all decrease affinity for alpha(2)beta delta(2) pentamers by 10,000-fold. Side chains at these four positions localize to a restricted region of the known three-dimensional structure of CTx MI. Mutations of the AChR reveal major contributions to CTx MI affinity by Tyr-198 in the alpha subunit and by the selectivity determinants Ser-36, Tyr-113, and Ile-178 in the delta subunit. By using double mutant cycles analysis, we find that Tyr-12 of CTx MI interacts strongly with all three selectivity determinants in the delta subunit and that delta Ser-36 and delta Ile-178 are interdependent in stabilizing Tyr-12, We find additional strong interactions between Gly-9 and Pro-6 in CTx MI and selectivity determinants in the delta subunit, and between Ala-7 and Pro-6 and Tyr-198 in the alpha subunit. The overall results reveal the orientation of CTx MI when bound to the alpha-delta interface and show that primarily hydrophobic interactions stabilize the complex.