Analysis of the kinetic and redox properties of NADH peroxidase C42S and C42A mutants lacking the cysteine-sulfenic acid redox center.
Analysis of the kinetic and redox properties of NADH peroxidase C42S and C42A mutants lacking the cysteine-sulfenic acid redox center.
复制标题
缺乏半胱氨酸-次磺酸氧化还原中心的 NADH 过氧化物酶 C42S 和 C42A 突变体的动力学和氧化还原特性分析。
DOI：
10.1021/bi00002a007
复制
发表时间：
1995
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Claiborne,A
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Parsonage,D;Claiborne,A
摘要：来自粪肠球菌10 C1的黄素蛋白NADH过氧化物酶除了FAD外，还含有一个不寻常的半胱氨酸-次磺酸（Cys-SOH）氧化还原中心。非黄素中心在还原（Cys-SH）和氧化（Cys-SOH）状态之间循环，并且野生型过氧化物酶的非天然半胱氨酸-磺酸（Cys-SO 3 H）形式的2.16 μ m晶体结构支持Cys 42的所提出的催化作用。在这项研究中，我们采用了定点诱变的方法，其中Cys 42被替换为Ser和Ala，其中没有侧链的氧化还原活性的能力。C42 S和C42 A突变体的还原滴定直接导致用1当量的连二亚硫酸盐或NADH完全还原FAD，与Cys-SOH中心的消除一致。直接测定FAD/FADH 2对的氧化还原电位，C42 S和C42 A过氧化物酶的值分别为-219和-197 mV，表明在两电子还原的野生型酶中Cys 42-SH的存在使黄素电位降低约100 mV。厌氧停流分析还原C42 S和C42 A过氧化物酶的NADH证明thatin这两种情况下黄素还原是迅速的，这些结果证实了酶监测，稳态动力学分析，其中，此外，营业额约0.04%的野生型酶。这些结果是完全一致的Cys 42在野生型NADH过氧化物酶的催化氧化还原循环中的作用，并间接支持其作为过氧化物中心的同源NADH氧化酶的功能。
Revised Manuscript Received October 20, 1994® abstract: The flavoprotein NADH peroxidase from Enterococcus faecalis 10C1 has beenshown to contain, in addition to FAD, an unusual cysteine-sulfenic acid (Cys-SOH) redox center. The non-flavin center cycles between reduced (Cys-SH) and oxidized (Cys-SOH) states, and the 2.16 Á crystal structure of the non-native cysteine-sulfonic acid (Cys-S03H) form of the wild-type peroxidase supports the proposed catalytic role of Cys42. In this study, we have employed a site-directed mutagenesis approach in which Cys42 is replaced with Ser and Ala, neither side chain of which is capable of redox activity. Reductive titrations of both C42S and C42A mutants lead directly to full FAD reduction with 1 equiv of either dithionite or NADH, consistent with elimination of the Cys-SOH center. Direct determinations of the redox potentials for the FAD/FADH2 couples yield values of—219 and—197 mV, respectively, for C42S and C42A peroxidases, indicating that the presence of Cys42-SH in the two-electron-reduced wild-type enzyme lowers the flavin potential by approximately 100 mV. Anaerobic stopped-flow analyses of the reduction of C42S and C42A peroxidases by NADH demonstrate thatin both cases flavin reduction is rapid; these results are confirmed by enzyme-monitored, steady-state kinetic analyses which, in addition, give turnover numbers approximately 0.04% that of wild-type enzyme. These results are entirely consistent with the role proposed for Cys42 in the catalytic redox cycle of wild-type NADH peroxidase and indirectly support its function as a peroxidatic center in the homologous NADH oxidase.
登录
查看更多内容
1.8 A 下二烯内酯水解酶的精细结构。
影响因子：
5.6
作者：
D. Pathak;David L. Ollis
通讯作者：
David L. Ollis
链球菌 NADH 过氧化物酶的非黄素氧化还原中心。
DOI：
--
发表时间：
1989
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Poole,LB;Claiborne,A
通讯作者：
Claiborne,A
来自粪链球菌 10C1 的 NADH 过氧化物酶的结构以 2.16 A 分辨率进行精炼。
影响因子：
5.6
作者：
Stehle,T;Ahmed,SA;Claiborne,A;Schulz,GE
通讯作者：
Schulz,GE
链球菌 NADH 过氧化物酶和 NADH 氧化酶的活性位点结构比较。
DOI：
--
发表时间：
1992
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Ahmed,SA;Claiborne,A
通讯作者：
Claiborne,A
单烷基化谷胱甘肽还原酶的过氧化物修饰。
DOI：
--
发表时间：
1991
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Miller,H;Claiborne,A
通讯作者：
Claiborne,A