草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析
草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析
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DOI：
10.11964/jfc.20160910553
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发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
刘盼婷
中科院分区：
文献类型：
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作者：
王改玲;王明成;李传凤;潘磊;刘盼婷
为研究草鱼抗菌肽NK-lysin基因的组成结构、在组织中的表达差异及其抑菌活性，实验根据已知鱼类NK-lysin基因保守区序列设计上下游引物，采用RT-PCR和RACE PCR技术克隆草鱼NK-lysin基因(Cinkl)，RT-PCR进行各组织间的表达分析，并构建Cinkl成熟肽的原核表达载体，采用琼脂糖孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性。结果显示，Cinkl cDNA全长768 bp，编码121个氨基酸；基因组DNA全长3 361 bp，包含4个外显子和3个内含子。经多序列比对分析和结构域预测表明，CiNkl氨基酸序列具有SAPLIP家族的特征：含有6个保守的半胱氨酸和saposin B蛋白结构域，与斑马鱼Nklc、Nkld的相似性分别为57.98%和63.03%。构建NK-lysin氨基酸序列系统进化树，发现CiNkl与斑马鱼Nklc、Nkld聚为一支。RT-PCR检测结果显示，Cinkl mRNA在所有检测的草鱼组织中均有表达，在脾脏中表达量最高，心脏、鳃、中肾和头肾的表达量次之，皮肤、脑、肝脏和肠有微量表达。pET-28b-MBP与CiNkl成熟肽序列构建的原核表达质粒在宿主菌Rosetta.(DE3)表达出约57 ku的可溶性融合蛋白，利用Ni-NTA His·Bind树脂进行纯化，CiNkl重组蛋白对G–细菌如大肠杆菌M15株、嗜水气单胞菌，以及G+细菌如金黄色葡萄球菌均具有抑菌活性。基于草鱼NK-lysin的组织表达特征和重组蛋白的抑菌活性，推测NK-lysin在草鱼的先天性免疫防御中发挥调节作用。