Expression, purification, and characterization of SARS coronavirus RNA polymerase.
Expression, purification, and characterization of SARS coronavirus RNA polymerase.
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DOI：
10.1016/j.virol.2005.02.017
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发表时间：
2005-05-10
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Ding J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Cheng A;Zhang W;Xie Y;Jiang W;Arnold E;Sarafianos SG;Ding J
严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS - CoV）的依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）对病毒复制至关重要，是抗SARS药物的一个潜在靶点。我们在此报道了N端谷胱甘肽S - 转移酶（GST）融合的SARS - CoV RdRp及其聚合酶催化结构域在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化。在纯化过程中，发现全长的GST - RdRp被切割成三个主要片段：一个N端的p12片段、一个中间的p30片段和一个包含催化结构域的C端p64片段，推测是由于细菌蛋白酶的作用。生化分析表明，全长的GST - RdRp具有RdRp活性，p64和p12片段形成一个复合物，表现出相当的RdRp活性，而GST - p64蛋白没有活性，这表明p12结构域可能通过参与模板 - 引物结合对聚合酶活性是必需的。非核苷类HIV - 1逆转录酶抑制剂对SARS - CoV RdRp活性没有明显的抑制作用。这项工作为SARS - CoV RdRp的生化和结构研究以及抗SARS药物的开发提供了基础。
The RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of SARS coronavirus (SARS-CoV) is essential for viral replication and a potential target for anti-SARS drugs. We report here the cloning, expression, and purification of the N-terminal GST-fused SARS-CoV RdRp and its polymerase catalytic domain in Escherichia coli. During purification, the full-length GST-RdRp was found to cleave into three main fragments: an N-terminal p12 fragment, a middle p30 fragment, and a C-terminal p64 fragment comprising the catalytic domain, presumably due to bacterial proteases. Biochemical assays show that the full-length GST-RdRp has RdRp activity and the p64 and p12 fragments form a complex that exhibits comparable RdRp activity, whereas the GST-p64 protein has no activity, suggesting that the p12 domain is required for polymerase activity possibly via involvement in template-primer binding. Nonnucleoside HIV-1 RT inhibitors are shown to have no evident inhibitory effect on SARS-CoV RdRp activity. This work provides a basis for biochemical and structural studies of SARS-CoV RdRp and for development of anti-SARS drugs.
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DOI：
10.1016/s0140-6736(03)13077-2
发表时间：
2003-04-19
期刊：
Lancet (London, England)
影响因子：
--
作者：
Peiris JS;Lai ST;Poon LL;Guan Y;Yam LY;Lim W;Nicholls J;Yee WK;Yan WW;Cheung MT;Cheng VC;Chan KH;Tsang DN;Yung RW;Ng TK;Yuen KY;SARS study group
通讯作者：
SARS study group
影响因子：
5.4
作者：
Gosert, R;Kanjanahaluethai, A;Baker, SC
通讯作者：
Baker, SC
影响因子：
5.4
作者：
Harcourt, BH;Jukneliene, D;Baker, SC
通讯作者：
Baker, SC
影响因子：
5.4
作者：
Bost, AG;Carnahan, RH;Denison, MR
通讯作者：
Denison, MR
DOI：
10.1038/nsb0495-303
发表时间：
1995-04-01
期刊：
NATURE STRUCTURAL BIOLOGY
影响因子：
--
作者：
ESNOUF, R;REN, JS;STUART, D
通讯作者：
STUART, D