Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.
Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.
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DOI：
10.1038/nprot.2013.016
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发表时间：
2013-03
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
在本协议中，我们描述了一个程序，以产生“DNA哑铃”-单分子的DNA与微观珠连接在每个末端-和技术，用于操纵个人的DNA哑铃。我们还详细介绍了设计和制造的微流控装置（流动池）与双光捕获操作DNA哑铃和可视化单个蛋白质-DNA复合物的单分子落射荧光显微镜。我们设计的流动池能够使捕获的分子在层流通道和无流动的“过滤器”之间快速移动。该储库提供了在没有外部流动力的情况下检查溶液中DNA-蛋白质复合物的形成的手段，同时仍然保持DNA的预定端到端延伸。这些特征有助于研究蛋白质-DNA相互作用中三维DNA构象和动力学的作用。流动池和试剂的制备各需要两天时间; DNA-哑铃原位组装和单个蛋白质-DNA复合物的成像需要另外一天时间。
In this Protocol, we describe a procedure to generate ‘DNA-dumbbells’ — single molecules of DNA with a microscopic bead attached at each end — and techniques for manipulating individual DNA-dumbbells. We also detail the design and fabrication of a microfluidic device (flow cell) used in conjunction with dual optical trapping to manipulate DNA-dumbbells and to visualize individual protein–DNA complexes by single-molecule epifluorescence microscopy. Our design of the flow cell enables the rapid movement of trapped molecules between laminar flow channels and a flow-free ‘reservoir’. The reservoir provides the means to examine formation of DNA–protein complexes in solution in the absence of external flow forces, while still maintaining a predetermined end-to-end extension of the DNA. These features facilitate examination of the role of three-dimensional DNA conformation and dynamics in protein–DNA interactions. Preparation of flow cells and reagents requires two days each; in situ DNA-dumbbell assembly and imaging of single protein–DNA complexes requires another day.
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影响因子：
16
作者：
Amitani, Ichiro;Baskin, Ronald J.;Kowalczykowski, Stephen C.
通讯作者：
Kowalczykowski, Stephen C.
影响因子：
3.9
作者：
Granéli, A;Yeykal, CC;Greene, EC
通讯作者：
Greene, EC
影响因子：
14.8
作者：
Lee, Woei Ming;Reece, Peter J.;Dholakia, Kishan
通讯作者：
Dholakia, Kishan
影响因子：
3.3
作者：
Candelli, Andrea;Wuite, Gijs J. L.;Peterman, Erwin J. G.
通讯作者：
Peterman, Erwin J. G.
DOI：
10.1073/pnas.87.1.21
发表时间：
1990-01-01
影响因子：
11.1
作者：
MENETSKI, JP;BEAR, DG;KOWALCZYKOWSKI, SC
通讯作者：
KOWALCZYKOWSKI, SC