Genetic code expansion to enable site-specific bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors in live cells.
Genetic code expansion to enable site-specific bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors in live cells.
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DOI：
10.1002/pro.4550
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发表时间：
2023-02
期刊：
影响因子：
8
通讯作者：
Sakmar, Thomas P.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Mattheisen, Jordan M.;Wollowitz, Jaina S.;Huber, Thomas;Sakmar, Thomas P.
关键词：
为了用于活细胞中表达的G蛋白偶联受体(GPCRs)的位点特异性生物正交标记，我们建立了一种基于荧光素酶的报告分析方法。该方法用于比较不同生物正交标记化学试剂的琥珀密码子抑制效率、受体功能和效率。我们使用该检测系统，利用三种不同的遗传密码扩展质粒系统，在GPCR的三个不同位点并排比较了三种不同的非规范氨基酸[4-叠氮基-L-苯丙氨酸、环丙烯-L-赖氨酸和反式-环辛基-2-烯-L-赖氨酸]的掺入效率。作为一个模型GPCR，我们设计了一个表位标记的C-C趋化因子受体5(CCR5)-RLuc3融合蛋白，用于在HEK293T细胞中表达。AZF、CPK和TCOK被满意地整合到异源表达的CCR5中。我们还进行了基于细胞的钙动员试验来衡量工程CCR5的功能，并且在相同的细胞中，我们使用含有连接到小分子荧光团或肽的生物正交链链基的异二价化合物对工程突变体进行了生物正交标记。含四嗪类化合物与含TCOK的CCR5反应动力学良好。然而，在含有四嗪化合物的CCR5活细胞中，使用反向电子需求Diels-Alder连接进行生物正交标记总体上比其他测试的反应略有效率。
For use in site‐specific bioorthogonal labeling of expressed G protein‐coupled receptors (GPCRs) in live cells, we developed a luciferase‐based reporter assay. The assay was used to compare amber codon suppression efficiency, receptor functionality, and efficiency of different bioorthogonal labeling chemistries. We used the assay system to compare side‐by‐side the efficiency of incorporation of three different noncanonical amino acids [4‐azido‐l‐phenylalanine (azF), cyclopropene‐l‐lysine (CpK), and trans‐cyclooct‐2‐en‐l‐lysine (TCOK)] at three different sites on a GPCR using three different genetic code expansion plasmid systems. As a model GPCR, we engineered an epitope‐tagged C‐C chemokine receptor 5 (CCR5)‐RLuc3 fusion for expression in HEK293T cells. Satisfactory incorporation of azF, CpK, and TCOK into heterologously expressed CCR5 was achieved. We also carried out cell‐based calcium mobilization assays to measure the function of the engineered CCR5, and in the same cells, we performed bioorthogonal labeling of the engineered mutants using heterobivalent compounds containing bioorthogonal tethering groups linked to either a small‐molecule fluorophore or a peptide. Favorable reaction kinetics of tetrazine‐containing compounds with CCR5 harboring TCOK was observed. However, bioorthogonal labeling in live cells of CCR5 harboring CpK with tetrazine‐containing compounds using the inverse electron demand Diels‐Alder ligation was overall slightly more efficient than other reactions tested.
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