Stepwise mechanism of HIV reverse transcriptase: primer function of phosphorothioate oligodeoxynucleotide.
Stepwise mechanism of HIV reverse transcriptase: primer function of phosphorothioate oligodeoxynucleotide.
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HIV逆转录酶的逐步机制：硫代磷酸寡脱氧核苷酸的引物功能。
作者：
C. Majumdar;C. Stein;J. Cohen;S. Broder;S. H. Wilson
已研究了纯化的 HIV 逆转录酶对引物的识别。早些时候我们发现 DNA 合成的反应途径是有序的，模板引物和游离酶结合形成反应序列中的第一个复合物（Majumdar 等，1988）。我们现在发现d(C)28是针对poly[r(A)].oligo[d(T)]作为template.primer的DNA合成的线性竞争性抑制剂，表明d(C)28和template.primer在反应方案中与相同形式的酶结合，即游离酶。硫代磷酸寡脱氧核苷酸 Sd(C)28 也是针对模板引物的线性竞争性抑制剂。然而，抑制的 Ki（约 2.8 nM）比 d(C)28 的抑制的 Ki 低约 200 倍。由于抑制是线性竞争性的，因此解离常数等于抑制的 Ki。过滤结合测定证实了 Sd(C)28 和酶之间的高亲和力结合，并产生了与抑制 Ki 相似的 KD。使用 Sd(C)28 作为引物、poly[r(I)] 作为模板进行 DNA 合成的底物动力学研究表明，Sd(C)28 的 Km 为 24 nM。因此，该引物的 Km 比酶引物结合的 KD (2.8 nM) 高 8 倍。这些结果可以计算酶-引物结合 (kon = 5.7 x 10(8) M-1 s-1) 和解离 (koff = 1.6 s-1) 的实时速率值。
Primer recognition by purified HIV reverse transcriptase has been investigated. Earlier we found that the reaction pathway for DNA synthesis is ordered, with template-primer and free enzyme combining to form the first complex in the reaction sequence (Majumdar et al., 1988). We now find that d(C)28 is a linear competitive inhibitor of DNA synthesis against poly[r(A)].oligo[d(T)] as template.primer, indicating that d(C)28 and the template.primer combine with the same form of the enzyme in the reaction scheme, i.e., the free enzyme. The phosphorothioate oligodeoxynucleotide Sd(C)28 also is a linear competitive inhibitor against template.primer. However, the Ki for inhibition (approximately 2.8 nM) is approximately 200-fold lower than the Ki for inhibition by d(C)28. Since the inhibition is linear competitive, the dissociation constant is equal to the Ki for inhibition. Filter binding assays confirmed high-affinity binding between Sd(C)28 and the enzyme and yielded a KD similar to the Ki for inhibition. Substrate kinetic studies of DNA synthesis using Sd(C)28 as primer, and poly[r(I)] as template, revealed that the Km for Sd(C)28 is 24 nM. The Km for this primer is, therefore, 8-fold higher than the KD for enzyme-primer binding (2.8 nM). These results enable calculation of real time rate values for the enzyme-primer association (kon = 5.7 x 10(8) M-1 s-1) and dissociation (koff = 1.6 s-1).
DOI：
--
发表时间：
1985-03
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
M. E. Mulligan;J. Brosius;W. R. McClure
通讯作者：
M. E. Mulligan;J. Brosius;W. R. McClure
影响因子：
2.9
作者：
KUCHTA, RD;MIZRAHI, V;BENKOVIC, SJ
通讯作者：
BENKOVIC, SJ
噬菌体 lambda OR 区域转录起始复合物的功能和物理特征。
DOI：
--
发表时间：
1985
期刊：
The Journal of biological chemistry
影响因子：
--
作者：
Hawley,DK;Johnson,AD;McClure,WR
通讯作者：
McClure,WR