Analysis of Tagged Proteins Using Tandem Affinity-Buffer Exchange Chromatography Online with Native Mass Spectrometry.
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DOI：
10.1021/acs.biochem.1c00138
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发表时间：
2021-06-22
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Wysocki, Vicki H.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Busch, Florian;VanAernum, Zachary L.;Lai, Stella M.;Gopalan, Venkat;Wysocki, Vicki H.
蛋白质的过表达和纯化是体外结构功能表征研究的关键。然而，由于宿主相关（如密码子使用、翻译率）和/或蛋白质特异性（如毒性、聚集）的挑战，一些蛋白质难以在异源系统中表达。因此，通常有必要测试多种过表达和纯化条件，以最大限度地提高功能蛋白的产量，特别是对于资源重的下游应用（例如，生物催化剂、三级结构测定、生物治疗）。在这里，我们描述了一种基于自动化液相色谱-质谱的方法，用于直接分析细胞裂解物中的目标蛋白。这种方法是通过耦合固定金属亲和色谱（IMAC）来实现的，IMAC利用了感兴趣蛋白质中的工程多组氨酸标签，以及基于大小排斥的在线缓冲交换（OBE）和天然质谱（nMS）。虽然我们在这里用相对简单的例子说明了概念的证明，但使用IMAC-OBE-nMS来优化大规模蛋白质生产的条件对于加快结构生物学和生物治疗计划可能是非常宝贵的。
Protein overexpression and purification are critical for in vitro structure–function characterization studies. However, some proteins are difficult to express in heterologous systems due to host-related (e.g., codon usage, translation rate) and/or protein-specific (e.g., toxicity, aggregation) challenges. Therefore, it is often necessary to test multiple overexpression and purification conditions to maximize the yield of functional protein, particularly for resource-heavy downstream applications (e.g., biocatalysts, tertiary structure determination, biotherapeutics). Here, we describe an automatable liquid chromatography–mass spectrometry-based method for direct analysis of target proteins in cell lysates. This approach is facilitated by coupling immobilized metal affinity chromatography (IMAC), which leverages engineered poly-histidine tags in proteins of interest, with size exclusion-based online buffer exchange (OBE) and native mass spectrometry (nMS). While we illustrate a proof of concept here using relatively straightforward examples, the use of IMAC–OBE–nMS to optimize conditions for large-scale protein production may become invaluable for expediting structural biology and biotherapeutic initiatives.
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