Temperature-sensitive variants of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome c produced by random mutagenesis of codons 43 to 54.
Temperature-sensitive variants of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome c produced by random mutagenesis of codons 43 to 54.
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通过密码子 43 至 54 的随机诱变产生的酿酒酵母 iso-1-细胞色素 c 的温度敏感变体。
DOI：
10.1016/0022-2836(91)80207-b
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发表时间：
1991
影响因子：
5.6
通讯作者：
Pielak,GJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Wang,XH;Pielak,GJ
在体外随机诱变中，来自酿酒酵母的Cyc1基因被用来产生一个包含iso-1-细胞色素c密码子43到54的突变体文库。该区域由一个进化多样性序列中的进化保守结构组成。该文库位于一个低拷贝数的酵母穿梭噬菌体上，被引入到一个缺乏细胞色素的酵母菌株中。利用含有功能性细胞色素的转化子在30℃和37℃的非发酵碳源甘油上生长的能力来确定近1000个转化子的表型。文库中约90%的错义突变体产生野生型表型，7%产生温度敏感型(Cycts)表型，3%产生非功能性(Cyc−)表型。对20个Cyc和30个Cyc−转化子的噬菌体进行了序列分析。所有的突变都发生在目标区域内。Cyc−转化子的1/3突变体和Cyct转化子的所有突变体都是错义突变体。来自Cyc−转化子的其余突变体为无义或移码突变体。仅Gly45、Tyr46、Thr49、Asn52或Ile53密码子内的错义突变就足以在变异蛋白质中产生温度敏感行为。推导出的氨基酸替换与野生型蛋白质的侧链动力学、二级结构和三级结构有很好的相关性。
In vitrorandom mutagenesis within theCYC1gene from the yeastSaccharomyces cerevisiaewas used to produce a library of mutants encompassing codons 43 to 54 of iso-1-cytochromec. This region consists of an evolutionarily conserved structure within an evolutionarily diverse sequence. The library, on a low-copy-number yeast shuttle phagemid, was introduced into a yeast strain lacking cytochromec. The ability of transformants harboring a functional cytochromecto grow on the non-fermentable carbon source glycerol at 30°C and 37°C was used to determine the phenotype of nearly 1000 transformants. Approximately 90% of the missense mutants present in the library give rise to the wild-type phenotype, 7% result in the temperature-sensitive (Cycts) phenotype, and 3% give rise to the non-functional (Cyc−) phenotype. Phagemids from 20 Cyctsand 30 Cyc−transformants were subjected to DNA sequence analysis. All the mutations occur within the targeted region. One-third of the mutants from Cyc−transformants and all the mutants from Cyctstransformants are missense mutants. The remaining mutants from Cyc−transformants are nonsense or frame-shift mutants. Missense mutations within the codons for Gly45, Tyr46, Thr49, Asn52 or Ile53 alone are sufficient to produce temperature-sensitive behavior bothin vivoand in the variant proteins. The deduced amino acid substitutions correlate remarkably well with side-chain dynamics, secondary structure and tertiary structure of the wild-type protein.
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