Charakterisierung der Dynamik der Kinase p38 in freiem und ligandgebundenem Zustand durch NMR‐Spektroskopie
Charakterisierung der Dynamik der Kinase p38 in freiem und ligandgebundenem Zustand durch NMR‐Spektroskopie
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NMR 光谱中自由和配体状态下激酶 p38 的动态特性
DOI：
10.1002/ange.200502770
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发表时间：
2006
影响因子：
--
通讯作者：
Harald Schwalbe
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Martin Vogtherr;K. Saxena;Swen Hoelder;Susanne Grimme;Marco Betz;Ulrich Schieborr;Barbara Pescatore;M. Robin;Laure Delarbre;T. Langer;K. Wendt;Harald Schwalbe
安吉街1009号2006，118，1008-1012 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，魏因海姆www. angewandte。德韦尔登。Weder die Überlappung von Signalen noch unvollständige Amidprotonierung [18] können der Grund sein，da ein ähnlicher Anteil von Signalen auch in selektiv 15N-markiertem Protein fehlt.信号灯25%的功率消耗主要来自于Ursachen。Die Zuordnung ist fast vollständig（79%）für die N-terminale Domäne der Kinase außer der C-Hop.在C-末端Teil sind das DFG-Motiv（Asp 168-Phe 169-Gly 170），连接物Aktivierungsschleife（Leu 171-Glu 178）和Subdomänen VIII和X的大Teile nicht zugordnet。蛋白激酶A（PKA）的基因测序在蛋白激酶A（PKA）基因的研究中有重要意义。[19]C-阻滞和激活是Kinasen的激活和分解过程中的一个过程。[20]Solche Bewegungen können das Verschwinden von NMR-Signalen erklären，da sie zu Linienverbreiterungen durch Austausch führen. Austauschprozesse können durch NMR-Spektroskopie leicht nachgeweisen韦尔登; man klassifiziert sie in schnell（ein durchschnittliches Signal），langsam（ein Signal für jede Konformation）oder intermediär（Signal ist stark verbreitert oder verschwunden）. Lassen sich experimentelle Gründe ausschließen，so weist das Verschwinden eines NMR-Signals unterhalb des Detektionslimits auf einen konformativen Austauschprozess in der intermediären Zeitskala hin，der zu starker Linienverbeiterung führt. DFG-Schleife（Asp 168-Phe 169-Gly 170）的NMR信号不存在。选择15 N-Phe标记p38，以研究DFG-Schleife。p38对13苯基丙氨酸进行还原，在1H，15 N-TROSY-光谱中找到12个，并进行标记（Abbildung 1）。DFG-Schleife中的Phe 169未检测到信号。通过选择性标记15 N-Phe突变体Phe 169 Tyr的光谱，可以识别12个信号的TROSY-光谱。Andere Feldstärken（400-900 MHz Protonenresonanzfrequenz），Temperaturen innerhalb des experimentell Möglichen（5- 358 C）und empfindlichere Aufnahmebedingungen（0.5 mm Protein，12 h Messzeit auf einem 900-MHz-Spektrometer mit Kryosondentechnik）führten zum gleichen Ergebnis. DFG-Schleife中Phe 169的酰胺信号的Fehlen在激酶Schließen的中间区域的中间Zeitskala中被检测到。沃登说，Diarylharnstoffverbindungen就像p38绑定的DFG out-Konformation一样。第38页中的绑定解决方案不是与DFG-in-Conformation兼容的[6]，而是必须通过DFG-Schleife的影响进行改进。在一个严重的影响下，Umwandlung DFG-in QDFG-out vollständig unterdrückt wird，sodass die Austauschlinienverbreiterung verschwindet and ein messbares Phe 169-Signal auftritt。这些将在第二代核磁共振光谱仪（Abbildung 2 a）中找到。所有13个信号都来自主结构。Asp 168-Phe 169是p38-Sequenz ist中的一个Asp-Phe-帕尔，通过一个带有选择性13 C '-标记Asp和15 N-标记Phe的探针的HNCO-实验来鉴别这些信号。Das Auftauchen des Phe169-Signals ist somit eine Bestätigung dafür，dass im inhibierten DFG-out-Zustand des Proteins keine Austauschprozesse und.
1009 Angew. Chem. 2006, 118, 1008–1012 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www. angewandte. de werden. Weder die Überlappung von Signalen noch unvollständige Amidprotonierung [18] können der Grund sein, da ein ähnlicher Anteil von Signalen auch in selektiv 15N-markiertem Protein fehlt. Das Fehlen von 25% der erwarteten Signale hat grundlegendere Ursachen. Die Zuordnung ist fast vollständig (79%) für die N-terminale Domäne der Kinase außer der C-Helix. Im C-terminalen Teil sind das DFG-Motiv (Asp168-Phe169-Gly170), die anschließende Aktivierungsschleife (Leu171–Glu178) und große Teile der Subdomänen VIII und X nicht zugeordnet. Bezeichnenderweise fehlen die entsprechenden Sequenzen ebenfalls in unserer Zuordnung der Proteinkinase A (PKA).[19] C-Helix und Aktivierungsschleife sind an Bewegungen im Rahmen von Aktivierung und Katalyse der Kinasen beteiligt.[20] Solche Bewegungen können das Verschwinden von NMR-Signalen erklären, da sie zu Linienverbreiterungen durch Austausch führen. Austauschprozesse können durch NMR-Spektroskopie leicht nachgeweisen werden; man klassifiziert sie in schnell (ein durchschnittliches Signal), langsam (ein Signal für jede Konformation) oder intermediär (Signal ist stark verbreitert oder verschwunden). Lassen sich experimentelle Gründe ausschließen, so weist das Verschwinden eines NMR-Signals unterhalb des Detektionslimits auf einen konformativen Austauschprozess in der intermediären Zeitskala hin, der zu starker Linienverbeiterung führt. Die NMR-Signale der DFG-Schleife (Asp168-Phe169-Gly170) wurden nicht zugeordnet. Selektiv 15N-Phe markierte p38 wurde zur Untersuchung der DFG-Schleife verwendet. p38 enthält 13 Phenylalaninreste, von denen 12 im 1H, 15N-TROSY-Spektrum gefunden und eindeutig zugeordnet wurden (Abbildung 1). Das nicht zu beobachtende Signal gehört zu Phe 169 in der DFG-Schleife. Dies wurde durch das Spektrum der selektiv 15N-Phe markierten Mutante Phe169Tyr bestätigt, die ein identisches TROSY-Spektrum mit 12 Signalen ergab. Andere Feldstärken (400–900 MHz Protonenresonanzfrequenz), Temperaturen innerhalb des experimentell Möglichen (5–358C) und empfindlichere Aufnahmebedingungen (0.5 mm Protein, 12 h Messzeit auf einem 900-MHz-Spektrometer mit Kryosondentechnik) führten zum gleichen Ergebnis. Das Fehlen des Amidsignals von Phe 169 in der DFG-Schleife unter allen getesteten Bedingungen lässt auf ein Konformationsgleichgewicht in der intermediären Zeitskala für diese Region der Kinase schließen. Es ist gezeigt worden, dass Diarylharnstoffverbindungen wie 2 an die DFG-out-Konformation von p38 binden. Die Bindung solcher Substanzen an p38 ist nicht mit der DFG-in-Konformation kompatibel [6] und muss daher konformative Austauschprozesse der DFG-Schleife beeinflussen. Bei einem hinreichend starken Effekt wird erwartet, dass die Umwandlung DFG-inQDFG-out vollständig unterdrückt wird, sodass die Austauschlinienverbreiterung verschwindet und ein messbares Phe169-Signal auftritt. Dies wird bei dem in Gegenwart von 2 erhaltenen NMR-Spektrum (Abbildung 2 a) tatsächlich gefunden. Alle 13 aus der Primärstruktur erwarteten Signale sind sichtbar. Da Asp168-Phe169 das einzige Asp-Phe-Paar in der p38-Sequenz ist, ließ sich die Identität des zusätzlichen Signals durch ein HNCO-Experiment an einer Probe mit doppelt selektiv 13C’-markiertem Asp und 15N-markiertem Phe belegen. Das Auftauchen des Phe169-Signals ist somit eine Bestätigung dafür, dass im inhibierten DFG-out-Zustand des Proteins keine Austauschprozesse und …
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DOI：
10.1073/pnas.94.6.2327
发表时间：
1997-03-18
影响因子：
11.1
作者：
Wang, ZL;Harkins, PC;Goldsmith, EJ
通讯作者：
Goldsmith, EJ
影响因子：
5.7
作者：
Wang, ZL;Canagarajah, BJ;Goldsmith, EJ
通讯作者：
Goldsmith, EJ
影响因子：
56.9
作者：
Schindler, T;Bornmann, W;Kuriyan, J
通讯作者：
Kuriyan, J
c-Abl 激酶结构域与小分子抑制剂 PD173955 和伊马替尼 (STI-571) 复合物的晶体结构。
影响因子：
11.2
作者：
Nagar,Bhushan;Bornmann,WilliamG;Pellicena,Patricia;Schindler,Thomas;Veach,DarrenR;Miller,WTodd;Clarkson,Bayard;Kuriyan,John
通讯作者：
Kuriyan,John