蛋白激酶AMPK高效制备及活性检测方法的建立
蛋白激酶AMPK高效制备及活性检测方法的建立
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DOI：
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
顾玉超
中科院分区：
文献类型：
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作者：
陈进;郭鑫鑫;李芯蕊;朱秋美;王蕊红;顾玉超
目的建立高效的腺苷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)的制备方法,并建立1种基于酶联免疫吸附(ELISA)法的AMPK的激酶活性检测方法以用于药物筛选。方法利用大肠杆菌表达系统,将AMPK的α、β和γ 3个亚基与钙调素依赖性蛋白激酶β(CAMKK β)共表达,重组AMPK被CAMKK β磷酸化修饰并激活,进而纯化得到具有激酶活性的重组AMPK蛋白复合体。根据AMPK底物乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化修饰位点(Ser79)设计合成生物素标记的多肽(SAMS)作为AMPK激酶的底物。在ATP存在的情况下AMPK对生物素标记的SAMS多肽进行磷酸化修饰,反应产物转移到链霉亲和素包被的酶标板中,SAMS多肽通过链霉亲和素结合到酶标板。以能够识别SAMS磷酸化修饰的抗体作为一抗进行ELISA检测,SAMS的磷酸化修饰水平反应AMPK的激酶活性。结果利用大肠杆菌表达系统成功得到有激酶活性的AMPK蛋白复合体,建立了ELISA检测AMPK的激酶活性方法。通过对AMPK激活剂A-769662检测,证明该方法可以用于AMPK激活剂/抑制剂的筛选。结论通过构建大肠杆菌共表达系统,成功获得了AMPK激酶,与传统方法相比更为简洁高效;建立的AMPK的激酶活性检测方法操作简单、准确度高且安全高效,有望用于海洋活性分子的大规模筛选,加快我国"蓝色药库"的开发。