Efficient Amber Suppression via Ribosomal Skipping for In Situ Synthesis of Photoconditional Nanobodies.
Efficient Amber Suppression via Ribosomal Skipping for In Situ Synthesis of Photoconditional Nanobodies.
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DOI：
10.1021/acssynbio.1c00471
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发表时间：
2022-04-15
影响因子：
4.7
通讯作者：
Tampe, Robert
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Joest, Eike F.;Winter, Christian;Wesalo, Joshua S.;Deiters, Alexander;Tampe, Robert
关键词：
遗传密码扩展是一种用于原位合成修饰蛋白质的通用方法。在mRNA翻译过程中，琥珀终止密码子被抑制以位点特异性地掺入非规范氨基酸。因此，纳米抗体可以配备有光笼化的氨基酸以根据需要控制靶结合。琥珀抑制和蛋白质合成的效率可以随着不可预测的背景表达而变化，原因很难理解。在这里，我们确定了一个实质性的限制，防止合成的纳米抗体与N-末端修饰的光控制。经过系统分析，我们假设纳米抗体的合成在翻译的早期阶段受到核糖体不准确性的严重影响。为了避免提前终止密码子的背景引起的通读，我们设计了一种基于核糖体跳跃的新抑制概念。作为一个例子，我们在哺乳动物细胞中产生了具有光活化靶标结合的胞内抗体。这些发现为遗传密码扩展提供了有价值的见解，并描述了一种用于生成修饰纳米抗体的通用合成路线，为化学工具的有效位点特异性整合开辟了新的视角。在药物药理学领域，我们灵活的胞内抗体概念构建了一个理想的平台来调节靶蛋白的功能和相互作用。
Genetic code expansion is a versatile method for in situ synthesis of modified proteins. During mRNA translation, amber stop codons are suppressed to site-specifically incorporate non-canonical amino acids. Thus, nanobodies can be equipped with photocaged amino acids to control target binding on demand. The efficiency of amber suppression and protein synthesis can vary with unpredictable background expression, and the reasons are hardly understood. Here, we identified a substantial limitation that prevented synthesis of nanobodies with N-terminal modifications for light control. After systematic analyses, we hypothesized that nanobody synthesis was severely affected by ribosomal inaccuracy during the early phases of translation. To circumvent a background-causing read-through of a premature stop codon, we designed a new suppression concept based on ribosomal skipping. As an example, we generated intrabodies with photoactivated target binding in mammalian cells. The findings provide valuable insights into the genetic code expansion and describe a versatile synthesis route for the generation of modified nanobodies that opens up new perspectives for efficient site-specific integration of chemical tools. In the area of photopharmacology, our flexible intrabody concept builds an ideal platform to modulate target protein function and interaction.
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