六种水稻病毒一步法多重RT-PCR快速检测方法的建立
六种水稻病毒一步法多重RT-PCR快速检测方法的建立
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DOI：
10.3969/j.issn.1674-7968.2022.04.001
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
吴建国
中科院分区：
文献类型：
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作者：
黄静;王晨一;兰彬源;丁新伦;张帅;吴建国
农业生产上水稻(Oryza sativa)病毒病的发生大多为复合侵染,仅通过病毒病症状学的诊断往往很难准确分辨,因此开发快速精准诊断多种水稻病毒病的检测技术,对于水稻病毒病害的精准测报具有重要应用价值。基于此,本研究根据当前我国南方农业生产上常见的6种水稻病毒,即水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)、水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)、水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的外壳蛋白(coat protein,CP)的基因序列,设计了特异性检测引物,建立了可同时检测6种病毒的一步法多重逆转录PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)体系,其结果表明一步法多重RT-PCR检测反应体系(总体系20 μL)中,RSV上下游引物浓度为10 μmol/L的体积加量为0.6 μL、RDV为0.4 μL、RGSV为0.3 μL、RRSV为0.4 μL、RBSDV为0.6 μL、SRBSDV为0.2 μL;Onestep RT/Taq Mix的用量确认为0.75 μL,5×反应缓冲液用量为4 μL,模板量为1 μg。多重RT-PCR参数设定为RNA反转录50 ℃ 30 min;预变性94 ℃ 2 min;94 ℃变性30 s;退火温度58 ℃,30 s;72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃终延伸10 min。研究结果表明该体系可同时高效精准地检测6种水稻病毒,极大地提高了检测效率;该方法可广泛应用于实验室精准检测、田间水稻病毒病和传毒介体的检测,也为相关产品的研发提供技术支持和参考依据。