Blocking PSD95‐PDZ3's amyloidogenesis through point mutations that inhibit high‐temperature reversible oligomerization (RO)
Blocking PSD95‐PDZ3's amyloidogenesis through point mutations that inhibit high‐temperature reversible oligomerization (RO)
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通过抑制高温可逆寡聚化 (RO) 的点突变来阻断 PSD95-PDZ3 的淀粉样蛋白生成
DOI：
10.1111/febs.16339
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发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Kuroda Yutaka
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Saotome Tomonori;Onchaiya Sawaros;Brindha Subbaian;Mezaki Taichi;Unzai Satoru;Noguchi Keiichi;Martinez Jose C.;Kidokoro Shun‐ichi;Kuroda Yutaka
突触后密度蛋白95的第三个PDZ结构域（PSD95‐PDZ3, 11 kDa， 103个残基）在高温下倾向于形成淀粉样原纤维。在中性pH下，PDZ3是天然折叠的，但它在高温下表现出一种特殊的三态热展开，具有可逆的寡聚化（RO）平衡，这与PDZ3这种小球状蛋白的展开不同。在这里，我们使用两种抑制高温RO的变体（F340A和L342A）和五种单丙氨酸突变的变体（其中我们将表面暴露的疏水残基突变为丙氨酸）来检测RO在PDZ3高温淀粉样蛋白形成中的作用。圆二色性（CD）、分析超离心（AUC）和其他光谱测量证实了天然结构在环境温度下的保留。采用差示扫描量热法（DSC）评估是否存在高温反转录酶，并通过硫黄素T （ThT）荧光和透射电子显微镜（TEM）检测变异的淀粉样变性。通过比较RO和ThT信号的比例，我们发现抑制高温RO的突变强烈抑制淀粉样蛋白的形成。另一方面，所有形成RO的变异体在与野生型PDZ3相同的条件下也形成淀粉样蛋白。
The third PDZ domain of the postsynaptic density protein 95 (PSD95‐PDZ3; 11 kDa, 103 residues) has a propensity to form amyloid fibrils at high temperatures. At neutral pH, PDZ3 is natively folded, but it exhibits a peculiar three‐state thermal unfolding with a reversible oligomerization (RO) equilibrium at high temperatures, which is uncharacteristic in the unfolding of a small globular protein as PDZ3 is. Here, we examined the RO's role in PDZ3's amyloidogenesis at high‐temperature using two variants (F340A and L342A) that suppress the high‐temperature RO and five single‐alanine‐mutated variants, where we mutated surface‐exposed hydrophobic residues to alanine. Circular Dichroism (CD), Analytical Ultracentrifuge (AUC), and other spectroscopic measurements confirmed the retention of the native structure at ambient temperature. Differential Scanning Calorimetry (DSC) was used to assess the presence or absence of the high‐temperature RO, and the amyloidogenicity of the variants was measured by Thioflavin T (ThT) fluorescence and Transmission Electron Microscopy (TEM). By comparing the fraction of RO and the ThT signal, we found that mutations that suppressed the high‐temperature RO strongly inhibited amyloidogenesis. On the other hand, all variants forming RO also formed amyloids under the same conditions as the wild‐type PDZ3.
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