Rapid LC-MS Method for Accurate Molecular Weight Determination of Membrane and Hydrophobic Proteins.
Rapid LC-MS Method for Accurate Molecular Weight Determination of Membrane and Hydrophobic Proteins.
复制标题
用于准确测定膜和疏水蛋白分子量的快速 LC-MS 方法。
DOI：
10.1021/acs.analchem.8b03843
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发表时间：
2018
影响因子：
7.4
通讯作者：
Campuzano,IainDG
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lippens,JenniferL;Egea,PascalF;Spahr,Chris;Vaish,Amit;Keener,JamesE;Marty,MichaelT;Loo,JosephA;Campuzano,IainDG
治疗靶标表征涉及许多组成部分，包括准确的分子量 (MW) 测定。了解准确的分子量可以让我们检测翻译后修饰、蛋白水解裂解的存在，更重要的是，可以检测是否生成并纯化了正确的构建体。变性液相色谱-质谱 (LC-MS) 可能是获取此信息的一种有吸引力的方法。然而，与可溶性蛋白的方法相比，膜蛋白 LC-MS 方法的探索和应用仍然相对不足。在这里，对多个梯度和柱化学的系统研究导致了 5 分钟变性 LC-MS 方法的开发，用于获取膜蛋白准确的 MW 测量值。使用膜蛋白（例如 GPCR 和离子通道）以及不同大小的双特异性抗体构建体对条件进行询问，目的是为社区提供以中高通量方式获得色谱和准确 MW 测量所必需的快速 LC-MS 方法。详细介绍的 5 分钟方法已成功对具有宽 MW 范围（17.5 至 105.3 kDa）的疏水性蛋白进行 MW 测量，并提供了证据表明某些构建体确实包含意外的修饰或序列剪切。这种快速 LC-MS 方法还能够基线分离甲酰化和非甲酰化 aquaporinZ 膜蛋白。
Therapeutic target characterization involves many components, including accurate molecular weight (MW) determination. Knowledge of the accurate MW allows one to detect the presence of post-translational modifications, proteolytic cleavages, and importantly, if the correct construct has been generated and purified. Denaturing liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) can be an attractive method for obtaining this information. However, membrane protein LC–MS methodology has remained relatively under-explored and under-incorporated in comparison to methods for soluble proteins. Here, systematic investigation of multiple gradients and column chemistries has led to the development of a 5 min denaturing LC–MS method for acquiring membrane protein accurate MW measurements. Conditions were interrogated with membrane proteins, such as GPCRs and ion channels, as well as bispecific antibody constructs of variable sizes with the aim to provide the community with rapid LC–MS methods necessary to obtain chromatographic and accurate MW measurements in a medium- to high-throughput manner. The 5 min method detailed has successfully produced MW measurements for hydrophobic proteins with a wide MW range (17.5 to 105.3 kDa) and provided evidence that some constructs indeed contain unexpected modifications or sequence clipping. This rapid LC–MS method is also capable of baseline separating formylated and nonformylated aquaporinZ membrane protein.
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